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简要说明：

本制品是一种基于WST-8的显色反应，利用吸光度检测，简单、快速、高灵敏地对血清、血浆等生物体液、组织、细胞以及组织或细胞培养上清等样品中谷氨酰胺酶活力进行检测的试剂盒。

检测原理：

在谷氨酰胺酶(GLS)的作用下，谷氨酰胺(Glutamine)水解生成谷氨酸(Glutamate)，谷氨酸在谷氨酸脱氢酶(GDH)的催化下生成ɑ-酮戊二酸(α-KG)，在这一反应过程中NAD⁺被还原为NADH；生成的NADH在电子耦合试剂的作用下将WST-8还原生成橙黄色的Formazan，在450nm左右有最大吸收峰。反应体系中Formazan的生成量与样品中谷氨酰胺酶的活性成正比。

产品特点：

• 本试剂盒检测灵敏度高，线性范围宽，样品用量少。本试剂盒在样品体积为50μL时，可检测活性低至8μU的谷氨酰胺酶，在0.16～33.3U/L范围内有良好的线性关系。
  
• 本试剂盒提供的检测裂解液有一定的通用性。使用本试剂盒中的BalbLysis Buffer A裂解获得的细胞或组织样品，也可以用于百奥莱博的其它代谢类试剂盒中同样使用BalbLysis Buffer A进行裂解的样品检测，通用性强；而且还可用于检测蛋白浓度、进行SDS-PAGE或一些较易溶解蛋白的Western检测。
  
• 本试剂使用灵活，检测速度快，适用范围广。本试剂盒可用于小鼠、大鼠、人等的血清、血浆、尿液等生物体液，细胞培养上清、组织或细胞样品等的检测，全程约1小时即可完成。本试剂盒不仅适合少量样品的检测，也非常适合高通量筛选的自动化操作系统。

产品组成：

组分	规格
BalbLysis Buffer A	20mL
Assay Buffer A	20mL
Assay Buffer B	20mL
Substrate A	200μL
Substrate B	200μL
WST-8	200μL
Enzyme Solution	200μL
Positive Control (50×)	20μL
Glutamate Standard (50mM)	50μL

保存：-20℃，避光，有效期1年。

注意事项：

• Assay Buffer A、Assay Buffer B、Substrate A、Substrate B和WST-8须完全解冻并平衡至室温后再使用，否则会影响检测结果。其它各溶液使用时应在冰上进行。
  
• Substrate B从-20℃拿出在融解过程中可能会有析出，平衡至室温后析出的部分会溶解，不会对检测结果产生影响。
  
• 经测试，本试剂盒相对稳定，检测所得的标准曲线的线性范围等通常和说明书中的描述一致，但是实际效果可能会因为实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，例如最高浓度点的数据偏低或不在线性范围内等，通常可以舍去异常点的数据，取在线性范围内的数据来拟合标准曲线。
  
• BalbLysis Buffer A制备的细胞和组织样品，应使用Assay Buffer A至少稀释5倍，使待测样品中的BalbLysis Buffer A含量不高于20%时，反应才可以正常进行。Assay Buffer A稀释5倍的BalbLysis Buffer A作为稀释液稀释的标准品，测定得到的检测浓度和Assay Buffer A作为标准品稀释液范围一致，但是在信号强度上会有些差异，可能会比Assay Buffer A作为标准品稀释液的信号值略低一些。
  
• 为减少稀释液产生的背景带来的误差，样品和标准品的稀释液应该根据样品的种类来定。当样品为BalbLysis Buffer A制备的细胞或组织的裂解样品时，样品应使用Assay Buffer A至少稀释5倍，标准品应使用Assay Buffer A稀释5倍的BalbLysis Buffer A作为稀释液稀释，当样品为血液等其它样品时，宜使用Assay Buffer A稀释。
  
• 血清、血浆等样品如果在4℃保存，宜尽快检测，用于酶活性检测时应尽量使用新鲜的样品，即在样品制备的当天完成，否则可能会影响检测结果的准确性。通常样品宜在-20℃保存，-80℃保存更佳。

使用方法：

• 样品的准备：
  
  • 血液样品的准备：对于血清样品，将全血在常温如25℃下放置30分钟～2小时，不要剧烈摇晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4℃约1000～2000×g离心10分钟，取黄色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黄色沉淀；对于血浆样品，将全血用肝素或者EDTA进行抗凝，4℃约1000～2000×g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆，注意不要吸取白色沉淀。血清和血浆都需置于冰上，如果不能立即检测，也可以分装并短期保存于-20℃或-80℃。对于冻存的样品，在检测前解冻后冰浴存放备用，使用前必须混匀。
    
  • 细胞或组织样品的准备：对于培养的贴壁细胞，PBS洗涤一次并吸净残留液体。对于培养的悬浮细胞，先适当离心(如100～500×g，5分钟)收集细胞到离心管内，弃上清并吸净残留液体。按照每100万细胞加入100～200μL BalbLysis Buffer A的比例加入裂解液，适当吹打，冰浴5～10分钟以充分裂解细胞。4℃约12000×g离心3～5分钟，取上清用于后续检测。对于组织样品，按照每10mg组织加入100μL BalbLysis Buffer A的比例，使用组织研磨仪或适合的玻璃匀浆器在约4℃或冰浴等低温条件下进行匀浆。4℃约12000×g离心3～5分钟，取上清用于后续检测。以上所有操作均需在4℃或冰上操作。制备好的细胞或组织样品如果不能立即检测，可以-20℃或-80℃冻存。
    
    • 对于细胞、组织等需要裂解的样品的准备，也可以用其它合适的裂解液进行裂解，但不同裂解液制备的样品的测定效果可能存在一定的差异，甚至有些裂解液可能会抑制酶活性。
    • 对于细胞或组织样品，如果需要测定样品中的蛋白浓度，推荐使用增强型BCA法蛋白浓度测定试剂盒或BCA法蛋白浓度测定试剂盒。
  • 细胞培养上清样品的准备：对于贴壁细胞，直接取培养液；对于悬浮细胞，离心取培养液。
• 试剂盒的准备：
  
  • 融解Assay Buffer A、Assay Buffer B、Substrate A、Substrate B和WST-8，平衡至室温后混匀备用。其它试剂存放于冰浴备用，使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
    
  • GLS反应工作液的配制。按照每个反应50μL的体积配制适量的GLS反应工作液。均匀混合44μL Assay Buffer B、2μL Substrate B、2μL WST-8、2μL Enzyme Solution，即可配制成50μL GLS反应工作液。根据待检测样品(包括标准品)的数量，配制适量的GLS反应工作液。具体配制方法参考下表。GLS反应工作液须现配现用。
    

    成分(μL)	样品数
    	1	10	20	50
    Assay Buffer B	44	440	880	2200
    Substrate B	2	20	40	100
    WST-8	2	20	40	100
    Enzyme Solution	2	20	40	100
    GLS反应工作液	50	500	1000	2500

    GLS反应工作液宜现用现配。配制好的GLS反应工作液在储存过程中可能会引起背景值升高，进而影响检测效果。GLS反应工作液的配制也可以在步骤3e即将完成前再进行，即配即用。
• 样品测定：
  
  • 谷氨酸标准曲线设置。取4μL Glutamate Standard (50mM)，加入196μL Assay Buffer A，混匀，配制成浓度为1mM的谷氨酸标准溶液。分别取1mM的谷氨酸标准溶液0、0.5、1、2.5、5、10、25、50μL加入96孔板的标准品孔中，并相应地用Assay Buffer A补足至50μL，此时，标准曲线的浓度分别为0、10、20、50、100、200、500、1000μM。
    
    • 如果检测BalbLysis Buffer A制备的细胞或组织样品，可以使用Assay Buffer A稀释5倍的BalbLysis Buffer A作为稀释液稀释标准品；如果检测血液、上清等无需处理的样品，可以直接使用Assay Buffer稀释标准品。
  • 阳性对照的设置。取适量的Positive Control (50×)，按照1:49的比例用Assay Buffer A将其稀释成1×，例如取Positive Control (50×) 2μL，加入Assay Buffer A 98μL，混匀即得100μL的Positive Control (1×)。用作阳性对照时，每孔使用50μL。
    
  • 取1～50μL样品或稀释后的样品至96孔板样品孔中，并相应地加入Assay Buffer A至样品孔中，补足至50μL。同时设置仅含Assay Buffer A的孔为空白对照。
    
    • 为确保样品数值在标准曲线范围内，建议进行预实验将样品设置多个稀释倍数，以确定样品中谷氨酰胺酶的大致活力，如果数值不在标准曲线范围内，请调整样品的稀释倍数或者样品的用量。
      
    • 如果检测BalbLysis Buffer A制备的细胞或组织裂解样品，请使用Assay Buffer A稀释5倍的BalbLysis Buffer A作为稀释液稀释；如果检测血液、上清等无需裂解处理的样品，可以使用Assay Buffer A稀释。样品总稀释倍数记为n (例如本步骤中对样品进行了2倍稀释，加入的“稀释后的样品”为5μL，则n=2×50/5=20)。
      
    • 对于血清、组织裂解液上清等复杂样品，建议将适当样品设置多个稀释倍数进行预实验，在适当的稀释倍数时，样品的信号值和样品中的蛋白量通常会呈现出良好的线性关系。再根据预实验的结果，选取适宜的稀释倍数用于后续的测定，否则即使信号值在标准曲线的线性范围内，也可能无法得到理想的检测结果。
  • (选做)谷氨酸或NADH的存在会对谷氨酰胺酶的检测产生干扰，如果样品中含有谷氨酸或NADH，须同时设置样品背景对照孔，具体设置方法同步骤3c，并在步骤3e时用相同体积的Assay Buffer A替代Substrate A。
    
  • 各孔(不包括背景对照孔)加入Substrate A 2μL，混匀，37℃避光反应30分钟。
    
    • 样品背景对照孔请用2μL Assay Buffer A替代Substrate A。
  • 各孔加入GLS反应工作液50μL，混匀。
    
  • 立即使用适当的酶标仪或微量紫外分光光度计测定A450，此时记录为0分钟读值A1。
    
  • 37℃避光反应20～30分钟，反应时间记为T，测定A450，记为A2。信号的增强取决于谷氨酰胺酶催化产生的谷氨酸的量，ΔA=A2–A1。
    
    • 为取得最佳的检测效果，反应时间可以根据待测样品中的谷氨酰胺酶活性进行调整，但是必须确保读数在标准曲线范围内。对于谷氨酰胺酶活性较高的样品，建议测定总时间为20分钟或30分钟，对应的测定间隔时间设为2分钟或5分钟；对于谷氨酰胺酶活性较低的样品，可以延长测定总时间为45至60分钟，对应的测定间隔时间设为5或10分钟。也可以连续测定30分钟，每隔1或2分钟测定1次，最后取检测数据中前期一段时间内呈现线性的数据用于分析和计算。
      
    • 随着反应时间的延长，高浓度标准品孔的信号值可能会达到平台期，从而导致其不在标准曲线的线性范围内，此时可以舍去异常点的数据，取在线性范围内的数据来拟合标准曲线。
      
    • 如果酶标仪没有温控功能，也可以在室温测定，但这样检测出来的是室温条件下的酶活性，此时酶活性可能会和37℃测定的数据略有偏差，不同的实验条件偏差的程度会有所不同。
  • 建立标准曲线，将ΔA带入标准曲线，即可算出在反应时间内样品中谷氨酰胺酶催化产生的谷氨酸的浓度(B)，如果样品的背景对照信号比较高，样品的信号值应减去样品背景对照的信号值。谷氨酸标准曲线可以参考图2，吸光度检测在5～1000μM浓度范围内有良好的线性关系。谷氨酰胺酶活力的计算公式如下：
    
    GLS (U/L)=B×n/T
    • B为步骤3i根据标准曲线确定的谷氨酸浓度(μM)；n为步骤3c样品总稀释倍数；T为步骤3h的反应时间(min)。
      
    • 谷氨酰胺酶活性单位的定义为：1个酶活力单位(unit,U)为在37℃条件下，每分钟生成1.0μmol的谷氨酸所需的酶量。
  • 如有必要，可以测定样品溶液中的蛋白浓度，这样可以计算出单位蛋白量中的谷氨酰胺酶酶活性。

应用效果：
本试剂盒提供了谷氨酰胺酶作用产物谷氨酸的标准溶液，可以通过绘制标准曲线(图2A)，计算出样品中的谷氨酰胺酶的酶活力。

图2.本试剂盒对谷氨酸标准品、小鼠肾脏裂解样品和HeLa细胞裂解液样品的检测效果图。图A为本试剂盒对谷氨酸标准品的检测效果图。50μL用Assay Buffer A稀释的不同浓度的谷氨酸标准品，加入2μL Substrate A并混匀后，37℃避光孵育30分钟，再加入50μL GLS反应工作液并混匀后，37℃避光孵育30分钟，在450nm处测定吸光度。谷氨酸标准品在5～1000μM浓度范围内有良好的线性关系。图B为本试剂盒对小鼠肾脏裂解样品和HeLa细胞裂解液样品的检测效果图。1.75μg蛋白量的小鼠肾脏裂解样品(Mouse Kidney)和3.2μg蛋白量的HeLa细胞裂解液样品(HeLa Cell)，加入2μL Substrate A并混匀后，37℃避光孵育30分钟，再加入50μL GLS反应工作液混匀后，37℃避光孵育30分钟，然后在450nm处测定吸光度。实际检测效果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。
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