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本制品是一种基于WST-8的显色反应，利用吸光度检测，简单、快速、高灵敏地对血清、血浆等生物体液、组织、细胞以及组织或细胞培养上清以及饮料等样品中甲醇含量进行检测的试剂盒。百奥莱博同时提供检测速度更快的WST-8显色法甲醇快速检测试剂盒(YTB1062)，全程约10分钟即可完成。

本试剂盒的检测原理请参考图1。甲醇在醇氧化酶(AOX)的作用下生成甲醛，生成的甲醛进一步在甲醛脱氢酶(FDH)的作用下生成甲酸，在这一反应过程中NAD⁺被还原为NADH；生成的NADH在电子耦合试剂的作用下将WST-8还原生成橙黄色的Formazan，在450nm左右有最大吸收峰。反应体系中Formazan的生成量与样品中甲醇的含量成正比。

• 本试剂盒检测灵敏度高，线性范围宽，样品用量少。本试剂盒在样品体积为20μL时，可检测浓度低至0.0005g/L的甲醇，在0.0005～0.1g/L浓度范围内有良好的线性关系。本试剂盒提供了甲醇标准溶液，可以通过绘制标准曲线(图2)，计算出样品中的甲醇含量。
  
  
  
  图2.本试剂盒检测甲醇标准品的标准曲线。20μL用Assay Buffer稀释的不同浓度的甲醇标准品，加入80μL Methanol反应工作液并混匀后，37℃避光孵育30分钟，在450nm处测定吸光度。甲醇标准品在0.0005～0.1g/L浓度范围内有良好的线性关系。实际检测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。
  
• 本试剂盒特异性高，检测速度快。本试剂盒中的甲醛脱氢酶能特异性的催化甲醇氧化产物甲醛的脱氢反应，而不能作用于乙醇或丙醇的氧化产物乙醛、丙醛等其它醛类，因此本试剂盒能高特异性地检测甲醇。同时，本试剂盒的检测速度较快，整个检测过程约30分钟即可完成。
  
• 本试剂盒提供的检测裂解液有一定的通用性。使用本试剂盒中的BalbLysis Buffer H for Metabolic Assay裂解获得的细胞或组织样品，也可以用于百奥莱博的其它代谢类试剂盒中同样使用BalbLysis Buffer H for Metabolic Assay进行裂解的样品检测，通用性强。
  
• 本试剂使用灵活，适用范围广。本试剂盒可用于小鼠、大鼠、人等的血清、血浆、尿液等生物体液，细胞培养上清、组织或细胞及饮料样品等的检测。本试剂盒不仅适合少量样品的检测，也非常适合高通量筛选的自动化操作系统。

• Methanol Standard (5g/L)具有一定的挥发性，使用后须及时旋紧管盖。
  
• Enzyme Solution A不可反复冻融，为取得良好的使用效果，第一次解冻后可适当分装保存。
  
• Assay Buffer、Substrate和WST-8须要完全解冻并平衡至室温后再使用，否则会影响检测结果。其它各溶液使用时应在冰上进行。
  
• 底物从-20℃取出在融解过程中可能会有析出，平衡至室温后析出的部分会复溶，不会对检测结果产生影响。
  
• 经测试，本试剂盒相对稳定，检测所得的标准曲线的线性范围等通常和说明书中的描述一致，但是实际效果可能会因为实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，例如最高浓度点的数据偏低或不在线性范围内等，通常可以舍去异常点的数据，取在线性范围内的数据来拟合标准曲线。
  
• 血清、血浆等样品如在4℃保存，宜尽快检测，否则可能会影响检测结果的准确性。通常样品宜在-20℃保存，-80℃保存更佳。

• 样品的准备：
  
  • 血液样品的准备。对于血清样品，将全血在常温如25℃下放置30分钟～2小时，不要剧烈摇晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4℃约1000～2000×g离心10分钟，取黄色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黄色沉淀；对于血浆样品，将全血用肝素或者EDTA进行抗凝，4℃约1000～2000×g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆，注意不要吸取白色沉淀。血清和血浆都需置于冰上，如果不能立即检测，也可以分装并短期保存于-20℃或-80℃。对于冻存的样品，在检测前解冻后冰浴存放备用，使用前必须混匀。
    
  • 细胞或组织样品的准备。对于培养的贴壁细胞，PBS洗涤一次并吸净残留液体。对于培养的悬浮细胞，先适当离心(如100～500×g，5分钟)收集细胞到离心管内，弃上清并吸净残留液体。按照每100万细胞加入100～200μL BalbLysis Buffer H for Metabolic Assay的比例加入裂解液，使用组织研磨仪或适合的玻璃匀浆器在约4℃或冰浴等低温条件下进行匀浆。对于贴壁细胞，使用细胞刮或细胞铲，刮铲下细胞后再进行匀浆。4℃约12000×g离心3～5分钟，取上清用于后续检测。对于组织样品，按照每10mg组织加入100μL BalbLysis Buffer H for Metabolic Assay的比例，使用组织研磨仪或适合的玻璃匀浆器在约4℃或冰浴等低温条件下进行匀浆。4℃约12000×g离心3～5分钟，取上清用于后续检测。以上所有操作均需在4℃或冰上操作。制备好的细胞或组织样品如果不能立即检测，可以-20℃或-80℃冻存。
    
  • 细菌样品的准备。取1.5～4mL OD600为0.5～2.0的菌液，5000×g 4℃离心10分钟，弃上清。用200μL BalbLysis Buffer H for Metabolic Assay重悬细胞，可短暂涡旋混合以充分重悬。使用组织研磨仪或适合的玻璃匀浆器在约4℃或冰浴等低温条件下进行匀浆。12000～16000×g (16000×g更佳) 4℃离心5分钟。小心吸取上清用于后继检测。制备好的细菌样品如果不能立即检测，可以-20℃或-80℃冻存。
    
    • 对于细胞、组织、细菌等需要裂解的样品的准备，也可以用其它合适的裂解液进行裂解，但不同裂解液制备的样品的测定效果可能存在一定的差异，甚至有些裂解液可能会对检测产生干扰。
      
    • 对于细胞或组织样品，如果需要测定样品中的蛋白浓度，推荐使用蛋白浓度测定试剂盒(增强型BCA法)或蛋白浓度测定试剂盒(BCA法)。
  • 细胞培养上清样品的准备。对于贴壁细胞，直接取培养液；对于悬浮细胞，离心取培养液。
    
  • 饮料样品。直接测定或适当稀释后进行检测。
• 试剂盒的准备：
  
  • 融解Assay Buffer、Substrate和WST-8，平衡至室温后混匀备用。其它试剂存放于冰浴备用，使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
    
  • Methanol反应工作液(Working Solution)的配制。按照每个反应80μL的体积配制适量的Methanol反应工作液。均匀混合72μL Assay Buffer、2μL Substrate、2μL WST-8、2μL Enzyme Solution A、2μL Enzyme Solution B，即可配制成80μL Methanol反应工作液。根据待检测样品(包括标准品)的数量，配制适量的Methanol反应工作液。具体配制方法参考下表。Methanol反应工作液须现配现用。
    

    样本数	1	10	20	50
    Assay Buffer (μL)	72	720	1440	3600
    Substrate (μL)	2	20	40	100
    WST-8 (μL)	2	20	40	100
    Enzyme Solution A (μL)	2	20	40	100
    Enzyme Solution B (μL)	2	20	40	100
    Working Solution (μL)	80	800	1600	4000

    • 由于酶溶液的用量较少且易沉降，必须注意在使用前先轻轻离心一下，然后适当混匀后再使用。
      
    • 甲醛及NADH的存在会对甲醇的检测产生干扰。如果样品含有甲醛或者NADH，须同时设置背景对照孔，加入不含Enzyme Solution A的Methanol反应工作液，即配制Methanol反应工作液时2μL Enzyme Solution A用Assay Buffer替代。
      
    • Methanol反应工作液宜现用现配。配制好的Methanol反应工作液在储存过程中可能会引起背景值升高，进而影响检测效果。Methanol反应工作液的配制也可以在步骤3b加样完成后再进行，即配即用。
      
    • 如果样品本身的背景比较严重，并且通过设置背景对照孔后的效果仍然欠佳时，可以考虑采用截留分子量为3kDa、5kDa或10kDa的超滤管对于待检测的样品进行超滤，取超滤取得的不含大分子量蛋白的液体作为样品进行检测。
• 样品测定：
  
  • 甲醇标准曲线设置。取2μL Methanol Standard (5g/L)，加入98μL Assay Buffer，混匀，配制成浓度为0.1g/L的甲醇标准溶液。分别取0.1g/L的甲醇标准溶液0、1、2、4、8、12、16、20μL加入96孔板的标准品孔中，并相应地用Assay Buffer补足至20μL，此时，标准曲线的浓度分别为0、0.005、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1g/L。
    
  • 取1～20μL样品或稀释后的样品至96孔板样品孔中，并相应地加入Assay Buffer至样品孔中，补足至20μL。同时设置仅含Assay Buffer的孔为空白对照。
    
    • 为确保样品数值在标准曲线范围内，建议进行预实验将样品设置多个稀释倍数，以确定样品中甲醇的大致浓度，如果数值不在标准曲线范围内，请调整样品的稀释倍数或者样品的用量。样品总稀释倍数记为n (例如本步骤中对样品进行了10倍稀释，加入的“稀释后的样品”为5μL，则n=10×20/5=40)。
      
    • 对于血清、组织裂解液上清等复杂样品，建议将适当样品设置多个稀释倍数进行预实验，在适当的稀释倍数时，样品的信号值和样品中的蛋白量通常会呈现出良好的线性关系。再根据预实验的结果，选取适宜的稀释倍数用于后续的测定，否则即使信号值在标准曲线的线性范围内，也可能无法得到理想的检测结果。
      
    • 组织样品中含有的醇氧化酶、醇脱氢酶等可能会分解甲醇，进而对检测结果造成一定的影响，在必要的情况下，可以将样品密封后在95℃孵育10分钟，以灭活样品中的醇氧化酶、醇脱氢酶等，然后再取样品进行甲醇的含量检测。例如对于肝脏样品的裂解液，强烈建议95℃孵育10分钟后再离心取上清进行检测。
  • 各孔加入Methanol反应工作液80μL，混匀，37℃避光反应30分钟。
    
    • 如有设置样品背景对照，样品背景对照孔加入不含Enzyme Solution A的Methanol反应工作液。对于细胞或组织裂解液，通常都需要设置背景对照孔。
      
    • 如果吸光度偏低，可适当延长反应时间，例如反应45或60分钟。随着反应时间的延长，高浓度标准品孔的信号值可能会达到平台期，从而导致其不在标准曲线的线性范围内，此时可以舍去异常点的数据，取在线性范围内的数据来拟合标准曲线。
  • 在450nm处测定吸光度。
    
  • 建立标准曲线，并计算样品中甲醇的浓度(A)，如果样品的背景对照信号比较高，样品的信号值应减去样品背景对照的信号值。甲醇标准曲线可以参考图2，在0.0005～0.1g/L浓度范围内有良好的线性关系。甲醇浓度的计算公式如下：
    
    C(g/L)=A×n
    • A为步骤3e根据标准曲线确定的甲醇浓度(g/L)；n为步骤3b样品总稀释倍数。
      
    • 如有必要，可根据甲醇的分子量32.04计算出样品中甲醇的摩尔浓度(mol/L)=C/32.04。