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本试剂盒可测各种动物血清（浆）、组织、培养细胞、细胞培养上清等样本中碱性磷酸酶活性。

碱性磷酸酶分解磷酸苯二钠，产生游离酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4-氨基安替吡啉作用经铁氰化钾氧化生成红色醌衍生物，根据红色深浅可以测定酶活力的高低。

• 快速简便：全程约40分钟，可测80例左右样本；
  
• 取样量微：常规操作取样量50μL，酶标仪操作仅需5μL即可测样本中的AKP活力；
  
• 稳定性好：试剂盒2～8℃存放3个月有效；
  
• 再现性好：变异系数CV=1.2%,20倍稀释线性仍然良好；
  
• 回收试验：X =99%；
  
• 受外界影响因素小：干扰因素少，重复性强；
  
• 测试面广：可测动物血清(浆)、组织、各种体液、灌流液、各种培养细胞以及细胞培养上清液等。

• 分光光度计/酶标仪/半自动生化分析仪（比色测定波长为520nm）
  
• 恒温水浴箱或气浴箱（孵育温度为37℃）
  
• 漩涡混匀器
  
• 微量移液器

• 如果所用的酶标仪没有此波长，可以用相近的510nm或者530nm波长均可，且510nm波长测定结果相较于530nm好一些。
  
• 由于加样量比较少，建议加样时将吸头靠近酶标板底部，缓慢加样，边加边将吸头上移，以保证吸头上样本残留量最少，减少因加样造成的误差。
  
• 所加试剂接近于水剂，所以对吸头的粘附性很小，但加试剂时还是需要注意，速度不宜太快，以免溅出酶标孔外。
  
• 加样或加试剂若靠壁加入则需靠近底部，前部分处理反应液量比较少，若靠近上端加样则会有部分黏附于酶标孔上端，从而造成反应不充分。
  
• 酶标孔比较小，所以混匀力度要适中，太剧烈则可能将液体溅出，太慢则混匀不充分。先将孔壁上的液体轻轻的震动落下，再前后、左右的摇动。
  
• 一般对于酶标板可能存在初始吸光度差异，最好使用之前先在相应的波长处测定其初始的吸光度，然后再加样测定。
  
• 正式实验前需要取2例预计差异最大的样本进行预试，若酶活力过高可将其稀释后测定OD值控制在0.2或0.3左右。若酶活力较低，则直接测定或加大一倍取样量后测定。

• 常规采集样本，样本可以是血清、血浆(肝素抗凝为佳)、细胞培养上清。组织或培养细胞处理后进行测定。
  
• 如样本收集后（如血清、血浆、组织、培养细胞、培养上清等）不能及时检测，请将样本置于-20℃以下保存（温度越低越好）。

• 血清(浆)等样本：直接使用。
  
  • 鸡血清(浆)中AKP活力较高，一般需要用生理盐水5倍或10倍稀释后测，其它种属可先预试后再测。
• 组织样本：准确称取待测组织的重量，按重量(g)∶体积(mL)=1∶9的比例，加入生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆，2500转/分钟，离心10分钟，取上清液待测(上清液需要测定其蛋白浓度，蛋白测定试剂盒本公司有售)。
  
• 细胞或培养液：参照附录III。

• 按下表加入相应成分
  

  成分	空白孔	标准孔	测定孔
  双蒸水(μL)	5
  0.1mg/mL酚标准应用液(μL)		5
  待测样本(μL)			5
  缓冲液(μL)	50	50	50
  基质液(μL)	50	50	50

• 充分混匀37℃水浴15分钟。
  
• 每孔加入150μL显色剂。
  
• 轻轻振摇孔板混匀，波长520nm，酶标仪测定各孔吸光度OD值。

• 液体样本计算方法，适用于培养液、血清、血浆等液体样本的计算。
  
  • 单位定义：100mL样本在37℃与基质作用15分钟产生1mg酚为1个金氏单位。
    
  • 计算公式：
    

    液体样本AKP活力 (金氏单位/100mL)	＝	A测定－A空白	×C标准×100×N
    		A标准－A空白

    C_标准：酚标准液浓度，即0.1mg/mL；N：样本测试前稀释倍数
• 组织样本计算方法，适用于培养细胞、组织等相关样本的计算。
  
  • 单位定义：每克组织蛋白在37℃与基质作用15分钟产生1mg酚为1个金氏单位。
    
  • 计算公式：
    

    组织、细胞样本AKP活力 (金氏单位/gprot)	＝	A测定－A空白	×C标准÷Cpr
    		A标准－A空白

    C_标准：酚标准液浓度，即0.1mg/mL；Cpr：样本蛋白浓度，单位是gprot/mL(prot指蛋白)

• 样本前处理
  准确称取待测组织的重量，按重量(g)∶体积(mL)＝1∶9的比例，加入9倍体积的生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆，2500转/分钟，离心10分钟，取上清液进行测定。
  
• 操作步骤
  
  • 按下表加入相应成分
    

    成分	空白孔	标准孔	测定孔
    双蒸水(μL)	5
    0.1mg/mL酚标准应用液(μL)		5
    待测样本(μL)			5
    缓冲液(μL)	50	50	50
    基质液(μL)	50	50	50

  • 充分混匀37℃水浴15分钟。
    
  • 每孔加入150μL显色剂。
    
  • 轻轻振摇孔板混匀，波长520nm，酶标仪测定各孔吸光度OD值。
• 计算举例
  例1．取2%大鼠肝组织匀浆5μL按步骤操作进行AKP测定。空白管吸光度0.0233，标准吸光度0.2603，测定吸光度0.0629。同时测定该2%大鼠肝组织匀浆蛋白浓度为3.528×10^-3g/mL，则计算如下：
  

  大鼠肝组织AKP活力 (金氏单位/gprot)	＝	0.0629－0.0233	×0.1÷(3.528×10-3)
  		0.2603－0.0233
  	＝	4.7361金氏单位/gprot

  
  例2．取10%罗非鱼肝组织匀浆5μL按步骤操作进行AKP测定，空白管吸光度0.0233，标准吸光度0.2603，测定吸光度0.1765。同时测定该10%罗非鱼肝组织匀浆蛋白浓度为4.1386×10^-3g/mL，则计算如下：
  

  罗非鱼肝组织AKP活力 (金氏单位/gprot)	＝	0.1765－0.0233	×0.1÷(4.1386×10-3)
  		0.2603－0.0233
  	＝	15.6191金氏单位/gprot

• 样本前处理
  血清（浆）可直接取样用于测定（个别含量过高的样本需稀释测定，如鸡血清）。
  
• 操作步骤
  
  • 按下表加入相应成分
    

    成分	空白孔	标准孔	测定孔
    双蒸水(μL)	5
    0.1mg/mL酚标准应用液(μL)		5
    待测样本(μL)			5
    缓冲液(μL)	50	50	50
    基质液(μL)	50	50	50

    • 鸡血清(浆)中AKP活力较高，一般需要用生理盐水5倍或10倍稀释后待测。
  • 充分混匀37℃水浴15分钟。
    
  • 每孔加入150μL显色剂。
    
  • 轻轻振摇孔板混匀，波长520nm，酶标仪测定各孔吸光度OD值。
• 计算举例
  例1．取人血请5μL按步骤操作进行AKP测定，测得空白孔吸光度为0.0233，标准孔吸光度为0.2603，测定孔吸光度为0.1585，则计算如下：
  

  血清AKP活力 (金氏单位/100mL)	＝	0.1585－0.0233	×0.1×100×1
  		0.2603－0.0233
  	＝	5.7046金氏单位/100mL

  
  例2．用生理盐水将大鼠血清稀释2倍后取5μL按步骤操作进行AKP测定，得空白孔吸光度为0.0233，标准孔吸光度为0.2603，测定孔吸光度为0.2694，则计算如下：
  

  血清AKP活力 (金氏单位/100mL)	＝	0.2694－0.0233	×0.1×100×2
  		0.2603－0.0233
  	＝	20.7679金氏单位/100mL

• 样本前处理
  
  • 细胞培养液：吸取培养液，1000～1500转/分钟。离心10分钟，取上清液测定。
    
  • 培养细胞：
    
    • 培养细胞的收集：
      
      • 悬浮培养细胞：可以直接通过离心收集沉淀细胞(1000转/分钟，离心10分钟，弃上清留沉淀细胞)
        
      • 贴壁培养的细胞：吸去上清，可通过细胞刮直接将细胞刮下，或者是用0.25%的胰酶室温消化2～3分钟，加培养液终止消化，用微量移液器轻轻吹打，将所有液体吸出转入EP管，然后1000转/分钟，离心10分钟，弃上清，留沉淀细胞，再加入1mL PBS轻轻吹打，再次1000转/分钟，离心10分钟，弃上清，留沉淀细胞待用。如暂时不做，则可以将细胞沉淀低温冻存，温度越低越好。
    • 培养细胞的破碎：
      
      • 研磨破碎：在细胞沉淀中加入一定量的缓冲液(10⁶的细胞一般加入0.3～0.5mL，缓冲液可以用PBS或生理盐水)，用手动玻璃匀浆器冰水浴研磨3～5分钟，或是用卡富隆电动研磨器冰水浴研磨3分钟待测。
        
      • 超声破碎：在细胞沉淀中加入一定量的缓冲液(10⁶的细胞一般加入0.3～0.5mL，缓冲液可以用PBS或生理盐水)，需要保证超声探头在液面以下，功率300W，冰水浴，每3～5s超声一次，间隔4次（每次间隔时间为30s左右）。
        
      • 化学裂解：贴壁培养的细胞，可直接将上清吸取后，直接在孔板或瓶中加入一定量的裂解液(覆盖满细胞)，裂解30～40分钟(可用显微镜观察细胞裂解情况)，再用微量移液器吸出待测，根据需要可用生理盐水或PBS进行一定的稀释。
• 操作步骤
  
  • 按下表加入相应成分
    

    成分	空白孔	标准孔	测定孔
    双蒸水(μL)	30
    0.02mg/mL酚标准应用液(μL)		30
    待测样本(μL)			30
    缓冲液(μL)	50	50	50
    基质液(μL)	50	50	50

    • 细胞水平的AKP活性较低，所以取样量相应的加大。
      
    • 取样量加大的同时，为防止标准孔吸光度过大，将0.1mg/mL标准应用液用蒸馏水再稀释5倍待测（标准浓度为0.02mg/mL）。
  • 充分混匀37℃水浴15分钟。
    
  • 每孔加入150μL显色剂。
    
  • 轻轻振摇孔板混匀，波长520nm，酶标仪测定各孔吸光度OD值。
• 计算举例
  例1．培养液的计算举例:
  取细胞培养液30μL按步骤操作进行AKP测定，测得空白孔吸光度为0.0263，标准孔吸光度为0.3172，测定孔吸光度为0.2698，则计算如下：
  

  培养液AKP活力 (金氏单位/100mL)	＝	0.2698－0.0263	×0.02×100×1
  		0.3172－0.0263
  	＝	1.4171金氏单位/100mL

  
  例2．培养细胞的计算举例：
  12孔板贴壁培养的成骨细胞，吸取培养液后，在孔板中加入0.2mL裂解液(0.1% Triton X-100)覆盖住细胞，将细胞裂解后从中取30μL按步骤操作进行AKP测定，测得空白孔吸光度为0.0263，标准孔吸光度为0.3172，测定孔吸光度为0.1465。同时，用BCA法测定其蛋白浓度为0.8546×10^-3gprot/mL，则计算如下：
  

  培养细胞AKP活力 (金氏单位/gprot)	＝	0.1465－0.0263	×0.02÷(0.8546×10-3)
  		0.3172－0.0263
  	＝	9.67金氏单位/gprot