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本试剂盒可测各种动物组织、培养细胞等样本中的H⁺/K⁺－ATP酶活力。可测动物组织、红细胞以及各种培养细胞、各种水产等，效果均佳。

ATP酶可分解ATP生成ADP及无机磷，测定无机磷的量可判断ATP酶活力的高低。


H⁺/K⁺－ATPase对胃酸的分泌及胃的消化功能具有重要的生理意义。70年代Forte等人首先在牛蛙胃粘膜上分离出一类能被K⁺专一激活而不被乌本苷抑制的ATPase，即H⁺/K⁺－ATPase。随后Lee·J等人又证明了含有该酶的膜囊泡运动跨膜运输质子的作用，从而为胃酸分泌的机理奠定了分子学基础。H＋、K＋-ATPase定位于胃粘膜壁细胞上，属于第二类质子泵，它通过自身的磷酸化(E₁→E₂)与去磷酸化(E₂→E₁)完成的H⁺/K⁺电中性跨膜离子转运，不断将壁细胞内的质子运输到膜外行使泌酸的功能。

• 快速简便：全程约50分钟。
  
• 取样量微：本法取样本量100μL。
  
• 稳定性好：试剂盒2～8℃存放6个月有效。
  
• 再现性好：变异系数CV=1.7%。
  
• 回收试验：X =103.3%。
  
• 受外界影响因素小：干扰因素少，重复性强。

组分	100管/48样	200管/96样	保存
试剂一	10mL×2	10mL×3	4℃
试剂二	7mL×1	7mL×2
试剂三	8mL×1	8mL×2
试剂四(粉剂)	2支	4支	-20℃
试剂五(粉剂)	2支	4支	4℃
试剂六	3mL	3mL×2
试剂七	10mL	10mL×2
试剂八(粉剂)	3瓶	5瓶
试剂九(粉剂)	1瓶	2瓶
试剂十：2.5mol/L硫酸	100mL	100mL×2	室温
试剂十一：10mmol/L磷标准贮备液	10mL	10mL	4℃

保存：2～8℃，有效期6个月。

• 试剂四的配制：用时每支试剂四粉剂加双蒸水至5mL，现用现配，余下的-20℃以下可保存1周。
  
• 试剂五的配制：用时每支试剂五粉剂加双蒸水至5mL，适当加热溶解，4℃保存。
  
• 试剂七应用液的配制：用时每支试剂七液体加双蒸水至25mL，室温保存。
  
• 试剂八的配制：用时每瓶试剂八加双蒸水至40mL溶解，溶解后4℃可保存一周。
  
• 试剂九的配制：用时每瓶试剂九粉剂加双蒸水至100mL溶解，室温保存。
  
• 0.5μmol/mL磷标准的配制：用时按10mmol/L磷标准贮备液∶双蒸水＝1∶19的比例配制，如取0.5mL加双蒸水9.5mL。
  
• 定磷剂的配制：按双蒸水∶2.5mol/L硫酸∶试剂八∶试剂九=2∶1∶1∶1的比例配制。配好的定磷剂应为浅黄色，若无色则试剂无效，若蓝色则为磷污染，定磷剂需现用现配。

准确称取胃粘膜组织重量，按重量(g)∶体积(mL)=1∶9的比例，加入9倍体积的生理盐水，冰水浴条件下制备成10%的组织匀浆液，2500转/分，离心10分钟，取上清液，再用生理盐水5倍稀释成2%的浓度待测。

• 具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格，要没有一点磷，若试管放过磷酸或磷酸缓冲液，一定要洗得非常干净，即先用洗洁精加水煮，再用自来水冲，最后用双蒸水冲干净。最好用一次性塑料管或新玻璃管，避免磷污染是检测成败的关键。
  
• 定磷剂配好后，不可放置太久，一般保存1～5天，最好现用现配。随时放冰箱。
  
• 最好采用先配A、B两种混合液，然后按简化操作步骤检测。这样快捷、准确。
  
• 所有配试剂的器皿均要专用，包括吸硫酸的吸管及盛水的器皿。

• 酶促反应：
  

  成分	对照管	测定管
  试剂一	130μL	130μL
  试剂二		80μL
  试剂三	120μL
  试剂四	40μL	40μL
  试剂五	40μL	40μL
  试剂六		40μL
  样本		100μL
  混匀37℃水浴10分钟。
  试剂七应用液	50μL	50μL
  样本	100μL
  混匀3500转/分，离心10分钟，取上清400μL上清作定磷反应。

• 定磷反应：
  

  管号	标准管	对照管	测定管
  0.5μmol/mL标准磷应用液	400μL
  对照管的上清液		400μL
  测定管的上清液			400μL
  定磷剂	2mL
  混匀45℃水浴5分钟，冷却至室温，660nm处，1cm光径，双蒸水调零，测各管吸光度值。

• 如果您的样品很多可以采用简便操作法
  测试前将对照管试剂及测定管试剂分别配成混合试剂A液和B液，具体配法如下：
  根据规范操作表中各管的试剂量乘以您所需要测试的样本数（n）再放1～2只管的量（避免吸到最后试剂量不够）然后纵向混合成A液（对照管的加液）及B液（测定管的加液），具体配制见下表：
  

  管号	对照管	测定管
  试剂一(μL)	130×(n+2)	130×(n+2)
  试剂二(μL)		80×(n+2)
  试剂三(μL)	120×(n+2)
  试剂四(μL)	40×(n+2)	40×(n+2)
  试剂五(μL)	40×(n+2)	40×(n+2)
  试剂六(μL)		40×(n+2)
  混合试剂总量(μL)	330×(n+2)	330×(n+2)
  每管应吸液量(μL)	330	330

• 简化操作步骤：
  • 酶促反应：
    

    管号	对照管	测定管
    对照管液(A液)	330μL
    测定管液(B液)		330μL
    样本		100μL
    混匀，37℃水浴准确反应10分钟。
    试剂七应用液	50μL	50μL
    样本	100μL
    混匀，离心3500转/分×10分钟，取上清400μL上清作定磷反应。

  • 定磷反应：
    

    管号	标准管	对照管	测定管
    0.5μmol/mL标准磷应用液	400μL
    对照管上清液		400μL
    测定管上清液			400μL
    定磷剂	2mL
    混匀，45℃水浴5分钟，冷却至室温，在660nm，1cm光径，双蒸水调零测各管吸光度值。

• 活力定义：
  规定每小时每毫克组织蛋白的ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷的量为一个ATP酶活力单位，即微摩尔磷/毫克蛋白/小时(μmolPi/mgprot/hour)。
  
• 计算公式：
  

  H+/K+－ATPase 活力(U/mgprot)	＝	A测定－A对照	×C标准×N÷	T	÷Cpr
  		A标准		60

  C_标准：标准品浓度，0.5μmol/mL；
  N：反应体系中样本的稀释倍数，4.8；
  T：反应时间，10min；
  Cpr：样本蛋白浓度，mgprot/mL（prot指蛋白）。

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