产品货号：
SNM125
中文名称：
超微量Ca-ATP酶测定试剂盒(测组织、普通细胞)
英文名称：
Ca2+-ATPase assay kit
产品规格：
50管/25样|100管/50样
发货周期：
1～3天
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ATP酶存在于组织细胞及细胞器的膜上，是生物膜上的一种蛋白酶，它在物质运送、能量转换以及信息传递方面具有重要的作用，机体在缺氧及一些疾病状态下，此酶活力发生一系列改变，另外有些遗传疾病也与此酶活力有关。
ATP酶可分解ATP生成ADP及无机磷，测定无机磷的量可判断ATP酶活力的高低。
- 快速简便：全程约50分钟，可测50例左右样本。
- 取样量微：本法取样本量100μL。
- 稳定性好：试剂盒2～8℃存放6个月有效。
- 再现性好：变异系数CV=1.7%。
- 回收试验：X =103.3%。
- 受外界影响因素小：干扰因素少，重复性强。
- 测试面广：可测动物组织以及各种培养细胞产等，效果均佳。
| 组份 | 说明 | 50管/24样 | 100管/48样 | 保存 |
| 试剂一 | 液体 | 4mL | 8mL | 4℃保存6个月 |
| 试剂二 | 液体 | 2mL | 3mL | 4℃保存6个月 |
| 试剂三 | 液体 | 2mL | 3mL | 4℃保存6个月 |
| 试剂四 | 粉剂 | 1支 | 2支 | -20℃保存6个月 |
| 试剂五 | 粉剂 | 1支 | 1支 | 4℃保存6个月 |
| 试剂六 | 粉剂 | 1支 | 1支 | 4℃保存6个月 |
| 试剂七 | 液体 | 3mL | 3mL | 4℃保存6个月 |
| 试剂八 | 10mmol/L标准磷贮备液 | 5mL | 5mL | 4℃保存6个月 |
| 试剂九 | 定磷剂甲液 | 7mL×2 | 7mL×4 | 4℃保存6个月 |
| 定磷剂乙液 | 6mL×2 | 6mL×4 | 4℃避光保存6个月 | |
| 试剂十 | 终止剂 | 30mL | 60mL | 室温保存6个月 |
| 双蒸水 | 60mL | 60mL | 4℃或室温保存 |
- 分光光度计/酶标仪/半自动生化分析仪（比色测定波长为636nm）
- 恒温水浴箱或气浴箱（孵育温度为37℃）
- 台式离心机
- 漩涡混匀器
- 微量移液器
- 试剂四工作液的配制：
用时每支试剂四粉剂加双蒸水5mL，充分溶解。（用不完-20℃以下可保存一周。） - 试剂五工作液的配制：
用时每支试剂五加双蒸水5mL，适当加热溶解，4℃保存3个月。 - 试剂六工作液的配制：
用时每支试剂六加双蒸水10mL，室温保存3个月。
注：试剂六为过饱和溶液，所以在配制时最好用90℃～100℃的热双蒸水10.3mL（热胀冷缩）边隔水加热边用玻璃棒搅拌，以使其充分溶解。一次实验用不完再用时可能有结晶，用之前可以再次边隔水加热边玻璃棒搅拌使其溶解。 - 试剂七工作液的配制：
用时每瓶试剂七加双蒸水4.5mL，4℃保存6个月。 - 0.1μmol/mL磷标准液的配制：
用时将10mmol/L磷贮备液100倍稀释，即取0.1mL加双蒸水至10mL。 - 0.02μmol/mL磷标准液的配制：
用时将0.1μmol/mL磷标准液用双蒸水5倍稀释，即取0.1μmol/mL磷标准液1mL加双蒸水4mL。 - 定磷剂应用液的配制：
用时取一瓶试剂九甲液加入一瓶已预温好试剂九乙液中，充分混匀，需提前0.5小时配制，2～8℃条件下至少可保存5天，配好的显色剂的量够做13个管子（如果你的样本量很少，所需的显色剂的量较少，那么你可以按试剂九中的甲液︰乙液=7︰6的比例自行配制显色剂，需多少配多少（按比例配制显色剂时要防止磷污染，最好用专用吸嘴）。
注：定磷剂乙液在冬天或4℃长时间保存时可能会出现凝胶状物质，37℃溶解不了，可将其60℃左右水浴10分钟即可完全溶解；甲液、乙液应防止磷污染。
- 组织样本：
准确称取组织重量，按重量(g):体积(mL)＝1:9的比例，加入9倍体积的生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆，2500转/分，离心10分钟，取上清液(即10%的匀浆上清液)，再用生理盐水10倍稀释成1%，同时用考马斯亮蓝试剂测定组织蛋白。如果预试结果太高，再将1%的组织匀浆稀释成不同浓度再次预试以决定取样浓度。 - 培养细胞：
将培养细胞消化，离心，弃上清，留下层细胞，每管加0.2～0.3mL生理盐水或匀浆介质制备成107/cm3细胞悬液，即107/mL，再进行破碎。破碎细胞的方法有如下三种，分别是匀浆器匀浆、超声粉碎机粉碎、反复冻融3次(此法有时会影响酶活力)。制备好的细胞悬液不需要离心，同时用考马斯亮蓝试剂测定蛋白。再将细胞匀浆液稀释成不同浓度进行预试以决定取样浓度。
注意：
- 测试加样前要先摇匀后取样。
- 不可用磷酸盐缓冲液或含磷的试剂作为样本匀浆或稀释样本。
- 预试结果将绝对吸光值(测定管OD值-对照管OD值)控制在0.2左右为宜。
- 酶促反应：
成分 对照管 Ca2+-ATPase测定管 试剂一(μL) 70 70 试剂二(μL) 20 试剂三(μL) 20 试剂四工作液(μL) 20 20 试剂五工作液(μL) 20 试剂六工作液(μL) 20 样本(μL) 100 混匀，37℃水浴准确反应10分钟 试剂七工作液(μL) 50 50 样本(μL) 100 混匀，3500转/分，离心10分钟，取上清150μL定磷。 - 定磷：
成分 空白管 标准管 对照管 测定管 双蒸水(mL) 0.15 0.02μmol/mL磷标准液(mL) 0.15 上清液(mL) 0.15 0.15 定磷剂应用液(mL) 0.5 0.5 0.5 0.5 混匀，室温静止2分钟 终止剂(mL) 0.5 0.5 0.5 0.5 混匀，室温静置5分钟，波长636nm，光径0.5cm，双蒸水调零，测定各管吸光度值。
注：在比色前，将比色皿用自来水冲洗10余次，再用双蒸水冲洗4～5次，以免磷污染。 - 组织ATPase的计算方法：
酶活定义：
规定每小时每毫克组织蛋白的组织中ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷的量为一个ATP酶活力单位。即微摩尔磷/毫克蛋白/小时（μmolPi/mgprot/hour）
计算公式：组织ATPase活力
(U/mgprot)＝ 测定OD值－对照OD值 × 标准品浓度
(0.02μmol/mL)×6×2.8÷ 待测样本蛋白浓度
(mgprot/mL)标准OD值－空白OD值
注：- 公式中×6是因为定义上为每小时，实际操作为10分钟反应，所以必须乘以6。
- 公式中×2.8是因为反应体系中2.8倍稀释。
- 公式中×6是因为定义上为每小时，实际操作为10分钟反应，所以必须乘以6。
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