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生物体内超氧阴离子等活性氧具有免疫和信号传导的作用，但积累过多时会对细胞膜及生物大分子产生破坏作用，导致机体细胞和组织代谢异常，从而引起多种疾病。

超氧阴离子与盐酸羟胺反应生成NO₂^－，NO₂^－在对氨基苯磺酸和α－萘胺的作用下，生成红色的偶氮化合物，在530nm处有特征吸收峰，根据ΔA值可以计算样品中O₂^－含量，反应式如下。

• OD值大于1，样品适当稀释再测定，注意计算公式里乘以稀释倍数。
  
• 样品制备好后，立刻进行测定，请勿将样品进行长时间的低温保存，以免影响测定结果。
  
• 试剂四有一定的毒性，请操作时做好防护措施。

• 植物、动物组织：组织质量(g)与提取液体积(mL)按照1∶5～10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后，10000g，4℃，离心20min，取上清置于冰上待测。
  
• 细菌、真菌样本：细胞数量（10⁴个）与提取液体积(mL)按照500～1000∶1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心20min，取上清置于冰上待测。
  
• 血清或培养液：直接测定。

• 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长至530nm。
  
• 按下表加入各成分。
  

  成分(μL)	空白管	测定管
  样本		200
  提取液	200
  试剂一	160	160

• 混匀，37℃水浴20min。
  

  成分(μL)	空白管	测定管
  试剂二	120	120
  试剂三	120	120

• 混匀，37℃水浴20min。
  
• 加入试剂四(自备氯仿)200μL
  
• 混匀，8000g，25℃，离心5min，小心吸取上层水相200μL于微量石英比色皿/96孔板中，测定A530。ΔA=A测定-A空白，空白管只要做一管。

• 用微量石英比色皿测定
  标准曲线：y=0.0242x - 0.0027，R²=0.9980
  
  • 组织样本：
    
    • 按照样本质量计算
      超氧阴离子含量(nmol/g鲜重)=(ΔA+0.0027)÷0.0242×V_反总÷(V_样÷V_样总×W)×2=148.76×(ΔA+0.0027)÷W
      超氧阴离子产生速率(nmol/g·min)=148.76×(ΔA+0.0027)÷W÷T=7.44×(ΔA+0.0027)÷W
      
    • 按照蛋白质浓度计算
      超氧阴离子含量(nmol/mg prot)=(ΔA+0.0027)÷0.0242×V_反总÷(V_样×Cpr)×2=148.76×(ΔA+0.0027)÷Cpr
      超氧阴离子产生速率(nmol/mg prot·min)=148.76×(ΔA+0.0027)÷Cpr÷T=7.44×(ΔA+0.0027)÷Cpr
  • 细菌、真菌样本：
    超氧阴离子含量(nmol/10⁴ cell)=(ΔA+0.0027)÷0.0242×V_反总÷(V_样÷V_样总×细胞数量)×2=148.76×(ΔA+0.0027)÷细胞数量
    超氧阴离子产生速率(nmol/10⁴ cell·min)=148.76×(ΔA+0.0027)÷细胞数量÷T=7.44×(ΔA+0.0027)÷细胞数量
    
  • 血清或培养液
    超氧阴离子含量(nmol/mL)=(ΔA+0.0027)÷0.0242×V_反总÷V_样×2=148.76×(ΔA+0.0027)
    超氧阴离子产生速率(nmol/mL·min)=148.76×(ΔA+0.0027)÷T=7.44×(ΔA+0.0027)
    V_样总：加入提取液体积，1mL；V_反总：反应总体积，0.36mL；V_样：反应中样品体积，0.2mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g；T：反应时间，20min；2:2分子O₂^－参与反应生成1分子NO₂^－。
• 用96孔板测定
  标准曲线：y=0.0121x - 0.0027，R²=0.9980
  
  • 组织样本：
    
    • 按照样本质量计算
      超氧阴离子含量(nmol/g鲜重)=(ΔA+0.0027)÷0.0121×V_反总÷(V_样÷V_样总×W)×2=297.52×(ΔA+0.0027)÷W
      超氧阴离子产生速率(nmol/g·min)=297.52×(ΔA+0.0027)÷W÷T=14.88×(ΔA+0.0027)÷W
      
    • 按照蛋白质浓度计算
      超氧阴离子含量(nmol/mg prot)=(ΔA+0.0027)÷0.0121×V_反总÷(V_样×Cpr)×2=297.52×(ΔA+0.0027)÷Cpr
      超氧阴离子产生速率(nmol/mg prot·min)=297.52×(ΔA+0.0027)÷Cpr÷T=14.88×(ΔA+0.0027)÷Cpr
  • 细菌、真菌样本：
    超氧阴离子含量(nmol/10⁴ cell)=(ΔA+0.0027)÷0.0121×V_反总÷(V_样÷V_样总×细胞数量)×2=297.52×(ΔA+0.0027)÷细胞数量
    超氧阴离子产生速率(nmol/10⁴ cell·min)=297.52×(ΔA+0.0027)÷细胞数量÷T=14.88×(ΔA+0.0027)÷细胞数量
    
  • 血清或培养液
    超氧阴离子含量(nmol/mL)=(ΔA+0.0027)÷0.0121×V_反总÷V样×2=297.52×(ΔA+0.0027)
    超氧阴离子产生速率(nmol/mL·min)=297.52×(ΔA+0.0027)÷T=14.88×(ΔA+0.0027)
    V_样总：加入提取液体积，1mL；V_反总：反应总体积，0.36mL；V_样：反应中样品体积，0.2mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g；T：反应时间，20min；2：2分子O₂^－参与反应生成1分子NO₂^－。