产品货号:
SK006-2
中文名称:
线粒体呼吸链复合体Ⅰ/NADH-辅酶Q还原酶测试盒(紫外分光光度法)
英文名称:
产品规格:
25管/24样
发货周期:
1~3天
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复合体Ⅰ(EC1.6.5.3)又称NADH-CoQ还原酶或NADH脱氢酶,广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中,是线粒体内膜中最大的蛋白复合物。该酶催化一对电子从NADH传递给CoQ,同时可使O2还原生成O2.-,是呼吸电子传递链上产生O2.-的主要部位。测定该酶活性,不仅可以反映呼吸电子传递链(ETC)状态,而且可以反映活性氧(ROS)生成状态。
复合体Ⅰ能够催化NADH脱氢生成NAD+,在340nm下测定NADH的氧化速率计算出该酶活性的大小。
组分 | 规格 |
试剂一 | 25mL |
试剂二 | 5mL |
试剂三 | 0.5mL |
试剂四 | 25mL |
试剂五 | 1mL |
试剂六 | 1支 |
保存:-20℃
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
- 试剂六粉剂用时加入2mL蒸馏水,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
- 工作液的配制:临用前将试剂五转移到试剂四中混合溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
- 准确称取0.1g组织或收集500万细菌或细胞,加入1mL试剂一和10μL试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
- 将匀浆600g,4℃离心5min。
- 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心10min。
- 可选:上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅰ。
- 步骤4中的沉淀即为线粒体,加入200μL试剂二和2μL试剂三,超声波破碎,用于复合体Ⅰ酶活性测定。
- 超声波破碎方法:冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10秒,重复30次。
- 分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
- 样本测定
- 工作液于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)孵育5min。
- 在1mL石英比色皿中加入40μL样本、800μL工作液和60μL试剂六,立即混匀,记录340nm处初始吸光值A1和2min后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。
- 工作液于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)孵育5min。
- 按蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。复合体Ⅰ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=1808×ΔA÷Cpr- 此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
- 按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。复合体Ⅰ活力(nmol/min/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W×V样÷V样总)÷T=365×ΔA÷W - 按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。复合体Ⅰ活力(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.73×ΔA
V反总:反应体系总体积,9×10-4L;
ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;
d:比色皿光径,1cm;
V样:加入样本体积,0.04mL;
V样总:加入提取液体积,0.202mL;
T:反应时间,2min;
W:样本质量,g;
500:细胞或细菌总数,500万。
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