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辅酶I NAD(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NAD⁺是糖酵解(EMP)和三羧酸循环(TCA)的主要氢受体，生成的NADH经呼吸电子链(ETC)传递把电子交给氧，在合成ATP的同时，形成大量的ROS，同时NADH再生为NAD⁺。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD⁺比值的高低可用于评价糖酵解和TCA循环的强弱。较高的NAD(H)及NADH/NAD⁺比值说明细胞呼吸耗氧量较高，处于过氧化状态。此外，NADH/NAD⁺比值升高也可抑制糖酵解和TCA循环。另外，NAD⁺降解产物对细胞信号传导、代谢和基因表达等具有重要的调控作用。

分别用酸性和碱性提取液提取样品中NAD⁺和NADH，NADH通过PMS的递氢作用，还原氧化型噻唑蓝(MTT)为甲瓒，在570nm下检测吸光值；而NAD⁺可被乙醇脱氢酶还原为NADH，进一步采用MTT还原法检测。

• 试剂三用时加入4mL蒸馏水，混匀，用不完的试剂4℃保存一周；
  
• 试剂四用时加入4mL蒸馏水，混匀，用不完的试剂4℃保存一周。

• 血清(浆)中NAD⁺和NADH的提取：
  
  • NAD⁺的提取：按照血清(浆)体积(mL)∶酸性提取液体积(mL)＝1∶5～10的比例(建议取约0.1mL血清(浆)，加入1mL酸性提取液)，60℃水浴5min(盖紧，以防止水分散失)；冰浴中冷却后，10000g 4℃离心10min；取500μL上清液，加入500μL碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
    
  • NADH的提取：按照血清(浆)体积(mL)：碱性提取液体积(mL)＝1∶5～10的比例(建议取约0.1mL血清(浆)，加入1mL碱性提取液)，60℃水浴5min(盖紧，以防止水分散失)；冰浴中冷却后，10000g 4℃离心10min；取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
• 组织中NAD⁺和NADH的提取：
  
  • NAD⁺的提取：按照组织质量(g)∶酸性提取液体积(mL)＝1∶5～10的比例(建议取约0.1g组织，加入1mL酸性提取液)，冰浴研磨，60℃水浴5min(盖紧，以防止水分散失)；冰浴中冷却后，10000g 4℃离心10min；取500μL上清液，加入500μL碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
    
  • NADH的提取：按照组织质量(g)∶碱性提取液体积(mL)等于1∶5～10的比例(建议取约0.1g组织，加入1mL碱性提取液)，冰浴研磨，60℃水浴5min(盖紧，以防止水分散失)；冰浴中冷却后，10000g 4℃离心10min；取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
• 细胞或细菌中NAD⁺和NADH的提取：
  
  • NAD⁺的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量(10⁴个)∶酸性提取液体积(mL)＝500～1000∶1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL酸性提取液)，超声波破碎(冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次)，60℃水浴5min(盖紧，以防止水分散失)；冰浴中冷却后，10000g 4℃离心10min；取500μL上清液，加入500μL碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
    
  • NADH的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量(10⁴个)∶碱性提取液体积(mL)＝500～1000∶1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL碱性提取液)，超声波破碎(冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次)，60℃水浴5min(盖紧，以防止水分散失)；冰浴中冷却后，10000g 4℃离心10min；取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

• 正式测定前务必取2～3个预期差异较大的样本做预测定
  
• 反应过程中注意避光。
  
• 若NAD⁺测定中△A≤0.0302，NADH测定中△A≤0.0222，已低于检测限，可做如下调整：
  
  • 将测定管避光静置时间20min延长到60min；
    
  • 在提取阶段增加取样量，即取0.2g样本或0.2mL样本加入1mL提取液。
• 由于每一个测定管需要设一个对照管，本试剂盒50管保证测24个NAD⁺或NADH。

• 分光光度计预热30min以上，调节波长至570nm，蒸馏水调零。
  
• 临用前将试剂一、试剂二、试剂三、试剂四分别加入250μL、75μL、75μL、75μL配制成混合液配成混合液，用多少配多少，配制后立即使用。
  
• 在1.5mL棕色EP管中按下表依次加样：
  

  成分(μL)	对照管	测定管
  样品	50	50
  混合液	475	475
  试剂六	500
  试剂五	35	35

• 充分震荡混匀，室温避光静置20min。
  
• 测定管中加入500μL试剂六。
  
• 充分混匀，静置5min后，20000g，25℃离心5min。
  
• 弃上清，沉淀中加入1mL试剂七。
  
• 混匀，570nm下比色，读取对照吸光值A1和测定管吸光值A2，计算△A=A2-A1。

• NAD⁺含量的计算
  标准条件下的回归曲线为y＝0.295x+0.0302，R2＝0.9978；其中y为△A，x为NAD⁺浓度nmol/mL
  
  • 血清(浆)中NAD⁺含量计算
    NAD⁺含量(nmol/mL)＝[(△A-0.0302)÷0.295×V₁)]÷(V₃×V₁÷V₂)＝67.8×(△A-0.0302)
    
  • 组织、细菌或细胞中NAD⁺含量计算
    
    • 按样本蛋白浓度计算
      NAD⁺(nmol/mg prot)＝[(△A-0.0302)÷0.295×V₁)]÷(V₁×Cpr)＝3.4×(△A-0.0302)÷Cpr
      
    • 按样本鲜重计算
      NAD⁺(nmol/g鲜重)＝[(△A-0.0302)÷0.295×V₁)]÷(W×V₁÷V₂)＝6.8×(△A-0.0302)÷W
      
    • 按细菌或细胞密度计算
      NAD⁺(nmol/10⁴ cells)＝[(△A-0.0302)÷0.295×V₁)]÷(500×V₁÷V₂)＝0.014×(△A-0.0302)
  
  
• NADH含量的计算
  标准条件下的回归曲线为y＝0.2808x+0.0222，R2＝0.9976；其中y为△A，x为NADH浓度nmol/mL
  
  • 血清(浆)中NADH含量计算
    NADH含量(nmol/mL)＝[(△A-0.0222)÷0.2808×V₁)]÷(V₃×V₁÷V₂)＝71.2×(△A-0.0222)
    
  • 组织、细菌或细胞中NADH含量计算
    
    • 按样本蛋白浓度计算
      NADH(nmol/mg prot)＝[(△A-0.0222)÷0.2808×V₁)]÷(V₁×Cpr)＝3.6×(△A-0.0222)÷Cpr
      
    • 按样本鲜重计算
      NADH(nmol/g鲜重)＝[(△A-0.0222)÷0.2808×V₁)]÷(W×V₁÷V₂)＝7.1×(△A-0.0222)÷W
      
    • 按细菌或细胞密度计算
      NADH(nmol/10⁴ cells)＝[(△A-0.0222)÷0.2808×V₁)]÷(500×V₁÷V₂)＝0.014×(△A-0.0222)

• V₁：加入反应体系中样本体积，0.05mL；
  
• V₂：加入提取液体积，2mL；
  
• V₃：加入血清(浆)体积：0.1mL；
  
• Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；
  
• W：样本质量，g；
  
• 500：细胞或细菌总数，500万。
  
• 最低检测限为0.1nmol/mL或0.1nmol/g鲜重或0.001nmol/mgprot。