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羟脯氨酸在胶原蛋白中占13.4%，在弹性蛋白中占极少量，其它蛋白中均不存在。而胶原蛋白大多分布在皮肤，腱，软骨，血管等处，因此羟脯氨酸的量能反映结缔组织疾病的胶原代谢情况。

有人把皮肤中羟脯氨酸的测定作为筛选抗衰老药物的一个指标。在发育阶段随年龄的增长，其羟脯氨酸在尿中排泄增加，而发育停止后稳定。老年人的羟脯氨酸比年轻人要少。

手术创伤会导至尿羟脯氨酸排泄量的增加，因高脂、低蛋白、酒精中毒及毒物、营养不良，或肝细胞变性坏色，通过炎症使纤维增加，分割肝小叶，导致肝硬化。肝纤维化时，肝内主要增加的成分为胶原纤维，羟脯氨酸为胶原纤维所特有，测定肝羟脯氨酸的含量，可换算成肝胶原蛋白的含量，以反映肝纤维化程度。胶原纤维分解主要依赖胶原酶和其它蛋白酶的作用，其分解产物羟脯氨酸从尿中排出，测定尿羟脯氨酸的含量，可反应胶原降解的情况。通过测定组织及尿中羟脯氨酸的含量，一方面可以判断纤维化程度，同时可以筛选预防与治疗的药物。

1. 试剂一应用液：
   临用时将粉末A一瓶，先加10mL的Buffer A-1充分溶解(从瓶口向内看，完全溶解完)。然后再加20mL的Buffer A-2充分混匀。配好后的试剂4～8℃ ℃冰箱保存3个月有效。
   注意：粉末A加Buffer A-1，10mL后一定要完全溶解后才能加Buffer A-2，20mL。
   
2. 试剂三应用液：
   临用时将粉末C一瓶，加到30mL的Buffer C-1中充分溶解，配好后的试剂4℃冰箱避光保存1个月有效。
   
3. 100μg/mL标准储备液的配制：
   测试前将一支标准品用蒸馏水溶解后定容至：测试前将一支标准品用蒸馏水溶解后定容至50mL，4℃冰箱保存2周。
   
4. 5μg/mL标准储备液的配制：
   取100μg/mL标准储备液1mL加蒸馏水定容至20mL，现用现配。

1. 样本水解：
   
   1. 血清(浆)：取0.5mL血清(浆)准确加水解液1mL，混匀。放试管中加盖后，95℃或者沸水浴水解20分钟。
      
   2. 尿液(培养液)：取1.0mL尿液(培养液)准确加水解液1mL，混匀。放试管中加盖后，95℃或者沸水浴水解20分钟。
      
   3. 组织：精确称取组织湿重30～100mg放入试管中，准确加水解液1mL，混匀。加盖后95℃或者沸水浴水解20分钟。(水解10分钟时混匀一次，目的是使水解更充分)。
2. 调pH值至6.0～6.8左右。
   
   1. 将各试管流水冷却后各管加指示剂10μL左右，摇匀；
      
   2. 各管准确加入调pH甲液1.0mL，混匀(此时溶液应为红色)；
      
   3. 用200μL的加样器吸取调pH的乙液向各管内逐滴小心加入调pH的乙液，每滴加入后均要混匀^*，直至液体中指示剂的颜色变成黄绿色^**。此时pH值在6.0～6.8左右(约加入调pH乙液100μL～500μL左右)；
      注^*：加调pH乙液时，每加一滴均要混匀，为防止液体外溢，如果没有带盖的玻璃磨口试管，可用普通玻璃试管代替，每次混匀时可用塑料薄膜或冰箱保鲜膜压住试管口，充分漩涡混匀即可。
      注^**：若您的样本是细胞培养液，因其中含有酚红，所以液体中的混合指示剂在pH为6.0～6.8左右时为橙黄红色，而不是黄绿色。
      
   4. 然后加蒸馏水至10mL，混匀；
      
   5. 取3～4mL稀释的水解液加适量活性炭(约20～30mg左右，以上清液离心后澄清无色为准)，混匀，3500转/分离心10分钟，小心取上清1mL作检测。
      注1：样本碱水解法的参考取样量：皮肤组织湿重0.03～0.05g，软骨湿重0.08～0.1g，肝组织湿重0.08～0.1g，细胞培养液0.5mL，血清(浆)0.5mL。
      注2：加水解液及调pH值甲液一定都要准确，否则较难调pH值。
      注3：样本称重时，一定要很准确，以免影响测定结果。先将组织在保鲜薄膜上剪成湿重约10mg左右的块状后再连同保鲜薄膜一起称重，称完后将样本放进试管中，再将保鲜薄膜称重，计算出组织净重量。
      注4：如果您的样本量少，则可以从取样，水解，调pH均按比例减少，不影响结果。
      注5：每次混匀时可用塑料薄膜或冰箱保鲜薄膜压住试管口，充分漩涡混匀，以免混匀过程中液体外溅。
      注6：95℃或者沸水浴时可以用带盖的玻璃磨口试管，也可用普通玻璃试管代替，用抱保鲜薄膜封口扎紧，用针头刺一小孔即可。我们建议用普通玻璃试管比带盖的玻璃磨口试管更安全。

1. 按下表加入各成分
   

   成分	空白管	标准管	测定管
   蒸馏水	1mL
   5μg/mL标准应用液		1mL
   检测液			1mL
   试剂一应用液	0.5mL	0.5mL	0.5mL

   
   
2. 混匀，静置10分钟。
   
3. 各管加入0.5mL试剂二。
   
4. 混匀，静置5分钟。
   
5. 各管加入0.5mL试剂三应用液。
   
6. 混匀，60℃水浴15分钟，冷却后，3500转/分离心10分钟，取上清在550nm处，1cm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度。

1. 血清(浆)、尿液的计算与举例
   
   1. 计算公式：
      

      羟脯氨酸含量 (μg/mL)	＝	测定管吸光度－对照管吸光度	×	标准管浓度 (5μg/mL)	×	水解液总体积
      		标准管吸光度－空白管吸光度				取样量

      
      
   2. 计算举例：
      
      1. 准确吸取正常大鼠血清0.5mL(样本量少，则可以从取样，水解，调pH均按比例减少。)按操作步骤进行检测。测得空白管吸光度为0.016，标准管吸光度为0.587，测定管吸光度为0.408。则计算结果为：
         

         羟脯氨酸含量 (μg/mL)	＝	0.408－0.016	×5×	10	＝68.651μg/mL
         		0.587－0.016		0.5

         
         
      2. 准确吸取正常人尿液1.0mL(样本量少，则可以从取样，水解，调pH均按比例减少。)按操作步骤进行检测。测得空白管吸光度为0.016，标准管吸光度为0.587，测定管吸光度为0.128。则计算结果为：
         

         羟脯氨酸含量 (μg/mL)	＝	0.128－0.016	×5×	10	＝9.807μg/mL
         		0.587－0.016		0.1

2. 组织的计算与举例
   
   1. 计算公式：
      

      羟脯氨酸含量 (μg/mg湿重)	＝	测定管吸光度－对照管吸光度	×	标准管浓度 (5μg/mL)	×	水解液总体积(mL)
      		标准管吸光度－空白管吸光度				组织湿重(mg)

      
      
   2. 计算举例：
      准确吸取正常大鼠肝组织湿重61.4mg(样本量少，则可以从取样，水解，调pH均按比例减少。)按操作步骤进行检测。测得空白管吸光度为0.015，标准管吸光度为0.538，测定管吸光度为0.161。则计算结果为：
      

      羟脯氨酸含量 (μg/mg肝组织湿重)	＝	0.161－0.015	×5×	10	＝227μg/mg肝组织湿重
      		0.538－0.015		61.4