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过氧化氢(H2O2)是体内的一种活性氧(ROS)状态，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。
本产品是利用过氧化氢特异性荧光探针过氧化氢探针O34检测过氧化氢的试剂盒。过氧化氢探针O34是合成的苯蒽类荧光探针，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，与细胞内过氧化氢反应，被氧化生成绿色荧光物质，绿色荧光强度与细胞内过氧化氢水平成正比，检测绿色荧光就可以知道细胞内过氧化氢的变化情况。
在激发波长488nm，发射波长526nm附近，使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪等检测绿色荧光，从而测定细胞内过氧化氢水平。


● 使用方便：可用激光共聚焦显微镜直接观察、荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测；
● 背景低，灵敏度高；
● 线性范围宽，使用方便。
检测方法：
● 流式细胞仪● 荧光显微镜● 激光共聚焦
样本类型：
● 悬浮细胞● 贴壁细胞
试剂盒以外自备仪器和试剂耗材：
● 激光共聚焦显微镜或荧光分光光度计或酶标仪或流式细胞仪。
● 离心机● 移液器● PBS缓冲液(pH7.4,1×) ● 或者HBSS(不含酚红)

组份	200T	400T
组份A：O34过氧化氢荧光探针	100μL	100μL×2
组份B：探针稀释液	1mL	1mL×2
说明书	1份	1份

探针-20℃避光保存，稀释液2～8℃保存。有效期6个月。
注：
● 探针长期不用可以-20℃保存，避免反复冻融，可以根据需要分装后冻存。
● 探针为DMSO溶液，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
● 可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
● 试剂开封后请尽快使用！


● 螺旋盖微量管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
● 荧光探针标记后，一定要洗净残余未进入细胞内的探针，否则导致背景较高。
● 探针标记完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的标记情况是否正常。
● 尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。
● 过氧化氢O34在光照和空气中易被氧化，注意避光密封保存。
● O34染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。
● O34对湿度非常敏感，若是O34溶液每次取完需要量后，必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量，分装密封保存。不可使用含水的吸头。
● 对不同的细胞，应选择合适的孵育时间和浓度，以观察过氧化氢的变化，很多细胞内的过氧化氢绝对水平较低，需要根据实际情况适当延长孵育时间。
● 过氧化氢O34探针可以根据需要的用量分装后冻存，避免反复冻融。
● 过氧化氢O34不可以一次性全部稀释后长期保存不用，稀释后稳定性变差，有效期缩短。


过氧化氢探针O34配制：
根据样本数量计算需要的用量，用探针稀释液5倍稀释过氧化氢O34探针后充分混匀，避光保存备用。
以下步骤中再用无血清培养基或HBSS缓冲盐溶液稀释100～200倍至染色所需的工作液浓度（最终500～1000倍稀释）
注：
● 可以不用试剂盒的稀释液，直接用HBSS或不含血清的培养基稀释探针母液至最终所需的工作液，500～1000倍稀释。
过氧化氢O34探针标记：
1、过氧化氢O34溶液可在新鲜无血清培养基、HBSS缓冲盐溶液或组织灌流液中稀释到所需浓度，终浓度按试剂盒的母液的200～1000倍稀释，以此染色液更换细胞培养液；也可直接向无血清细胞孵育液体中加入过氧化氢O34探针溶液至所需浓度。
注：
● 最后染色时的染色工作液所指的稀释倍数是相对于试剂盒中探针母液的稀释倍数而言。例如最终采用500倍稀释使用，在上一步已经用试剂B探针稀释液5倍稀释，再用无血清培养基或者HBSS缓冲液100倍稀释即可。
● 以下所有的稀释倍数都是指最终工作液的稀释倍数，不是把5倍稀释过的探针再进行500倍稀释。
2、依据细胞过氧化氢含量的不同，过氧化氢O34探针终浓度可选择在200～1000倍稀释的范围，一般500倍稀释即可。孵育时间可选择20分钟～4小时，在37℃或室温进行避光孵育。
3、孵育结束后，用PBS等新鲜溶液清洗细胞或组织。漂洗时间要短。
原位标记：仅适用于贴壁培养细胞。
1、按照1:500～1000用无血清培养基稀释O34探针。
注：
● 不能用含有血清的培养基稀释O34探针。
● 也可以用HBSS缓冲液稀释探针。
2、去除细胞培养基，用PBS洗细胞一次。
3、加入适当体积稀释好的O34探针。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的O34探针不少于1mL。
4、在37℃细胞培养箱内避光孵育20～60分钟。
5、用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的O34探针。
注：
● 也可以用HBSS/PBS洗涤细胞。
收集后标记：悬浮细胞或贴壁细胞消化处理。
1、按照1:500～1000用无血清培养基稀释O34探针。
注：
● 不能用含有血清的培养基稀释O34探针。
● 也可以用HBSS缓冲液稀释探针。
2、离心移除培养基，用PBS洗细胞一次。
3、细胞收集后悬浮于稀释好的O34探针中，细胞浓度为1×106～2×107mL，37℃细胞培养箱内避光孵育20～60分钟。每隔3～5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。
4、用无血清细胞培养基洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的O34探针。
5、用无血清细胞培养基重悬细胞。
注：
● 也可以用HBSS/PBS洗涤细胞。
荧光显微镜观察：
1、对贴壁生长细胞或活组织，可直接在荧光显微镜下观察；对悬浮生长细胞，取25～50μL细胞悬液滴到一张显微载玻片上，再盖上一张盖玻片。
2、荧光显微镜下观察。
流式细胞仪分析：
1、对贴壁生长细胞，用胰酶消化制备成单细胞悬液；对悬浮生长细胞，直接收集细胞。用0.5～1mL冰冷PBS重悬细胞(5～10万)。
2、采用488nm波长激发，测定待测细胞平均荧光强度。使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。探针O34的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测探针O34产物。
相关搜索：过氧化氢检测试剂盒(荧光法)-O34