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活性氮（reactive nitrogen species，RNS）是指NO与包括活性氧在内的化合物相互作用，生成一系列包括ONOO?及其质子形式过氧亚硝酸(HOONO)等具有高度氧化活性的自由基和硝基类化合物，这些与活性氧相对应的以NO为中心的衍生物称为活性氮。活性氮主要包括氮氧化物一氧化氮（NO）和二氧化氮（NO2）、过氧化亚硝酰阴离子（ONOO?）、亚硝酰氢（HNO）、亚硝酸根离子（NO2-）和氨等。
冰冻切片活性氮检测试剂盒是一种利用荧光探针O52进行活性氮检测的试剂盒。O52是一种细胞膜通透性的荧光探针，被活性氮特异性氧化生成绿色荧光物质，绿色荧光强度与活性氮水平成正比，检测绿色荧光就可以知道组织内活性氮的水平。
在激发波长490nm，发射波长516nm附近，使用荧光显微镜/激光共聚焦检测绿色荧光，从而测定样本内活性氮水平。


● 使用方便：可用荧光显微镜直接观察；
● 背景低，灵敏度高；
● 线性范围宽，使用方便。
检测方法：
● 荧光显微镜● 激光共聚焦显微镜
样本类型：
● 新鲜冰冻切片
试剂盒以外自备仪器和试剂耗材：
● 荧光显微镜/激光共聚焦显微镜● 离心机● 移液器● PBS ● HBSS（不含酚红）

组份	100T	200T
组份A：活性氮荧光探针O52	100μL	100μL×2
组份B：10×清洗液B	10mL	20mL

探针-20℃避光保存；清洗液2～8℃保存。有效期6个月。
注：
● 染料长期不用可以-20℃保存。避免反复冻融。
● 染色液A为DMSO溶液，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
● 可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。


● 螺旋盖微量管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
● 尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。
● 对于某些样本，如果荧光太强，可以按照1：200-1：1000稀释探针。探针标记的时间也可以根据情况在20～60分钟内适当进行调整。
● 以下操作步骤仅供参考，请根据实际样本情况调整。


一、试剂配制
1.根据样本数，用纯水将O52活性氮荧光探针100～200倍稀释，配成染色工作液。
2.用纯水将10×清洗液10倍稀释，配成1×清洗液工作液。
二、探针标记
1.准备待测的厚为10μm的未经固定处理的冰冻切片。
【注】:
● 必须使用新鲜组织（手术切除后1小时内）制成的冰冻切片。否则不新鲜样本可能检测不到活性氮。
2.室温下，小心加上200μL清洗液工作液，铺满整个切片表面，静置3～5分钟。
3.小心吸除清洗液。
4.滴加100μL染色工作液，在37℃培养箱避光孵育20～60分钟。
【注】:
● 最好在湿盒中孵育，避免液体蒸发。
5.移除染色液。
6.用PBS洗涤切片2～3次。
7.加盖玻片或甘油封片。
8.荧光显微镜检测。
【注】:
● 染色完成后，立即进行荧光定性分析。
● 激发波长488nm，发射波长516nm。
● 荧光强，表明活性氮（RNS）含量高。
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