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本制品是一种利用超氧阴离子特异性荧光探针O76进行超氧阴离子检测的试剂盒。O76可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内的超氧阴离子(O₂^-·)氧化，产生绿色荧光产物。根据活细胞中绿色荧光的产生，可以判断细胞O₂^-·>含量的多少和变化。用流式细胞仪或荧光显微镜可直接观察，是一种快速简便的组织或培养活细胞中超氧阴离子检测方法。
在激发波长506nm，发射波长526nm附近，使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪等检测荧光，从而测定细胞内超氧阴离子(O₂^-·)水平。


● 使用方便：可用激光共聚焦显微镜直接观察、荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测；
● 背景低，灵敏度高；
● 线性范围宽，使用方便。
检测方法：
● 流式细胞仪● 荧光显微镜● 激光共聚焦
样本类型：
● 悬浮细胞● 贴壁细胞
试剂盒以外自备仪器和试剂耗材：
● 激光共聚焦显微镜或荧光分光光度计或酶标仪或流式细胞仪，激发波长506nm，发射波长526nm。
● 离心机● 移液器● PBS缓冲液● HBSS（无酚红）

组分	100-200T	200-400T
超氧阴离子荧光探针O76	100μL	100μL×2

-20℃避光保存，有效期1年。
注：
● 长期不用可以-20℃保存，避免反复冻融。可以根据需要分装后冻存。
● 探针为DMSO溶液，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
● 可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。


● 螺旋盖微量管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
● 荧光探针标记后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
● 探针标记完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的标记情况是否正常。
● 尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。
● O76探针在光照和空气中易被氧化，注意避光密封保存。
● 对不同的细胞和组织，应选择合适的孵育时间和浓度，以观察超氧阴离子(O₂^-·)的变化。


O76探针标记：
1、O76溶液可在新鲜无血清培养基、HBSS缓冲液、PBS缓冲盐溶液稀释到所需浓度，200～500倍稀释，以此染色工作液更换细胞培养基；也可直接向细胞孵育液体中加入O76探针溶液至所需浓度。
注：
● 开始实验前，使用HBSS缓冲液或无血清培养基稀释染料储存液到需要的工作浓度。工作浓度应根据不同细胞的预实验结果确定的最佳工作浓度，建议至少在超过10倍范围的浓度下进行测试。一般染色终浓度200～500倍稀释，500倍适合大多数细胞样本。
● 建议收到产品后，根据单次使用量，对母液进行小量分装，每次使用一管，试剂-20℃避光冻存，一年稳定。
● 工作液现配现用。
2、依据细胞超氧阴离子含量的不同，O76终浓度可选择在200～500倍稀释的范围，孵育时间可选择10～90分钟，在37℃或室温进行避光孵育。
3、孵育结束后，用新鲜溶液清洗细胞或组织。
4、用相关仪器进行荧光检测。
注：
● 荧光强，超氧阴离子(O₂^-·)强度高。
荧光显微镜检测：
1、对贴壁生长细胞或活组织，可直接在荧光显微镜下观察；对悬浮生长细胞，取25～50μL细胞悬液滴到一张显微载玻片上，再盖一张盖玻片。
2、荧光显微镜下，用蓝光或绿光激发，观察和拍摄细胞绿色发射图像，超氧阴离子阳性细胞在整个核区被染成绿色。
流式细胞仪分析：
1、对贴壁生长细胞，用胰酶消化制备成单细胞悬液；对悬浮生长细胞，直接收取细胞。用0.5～1mL冰冷PBS重悬细胞（5～10万）。
2、采用480～535nm波长激发，测定590～610nm的发射，细胞可能分成两个亚群：超氧阴离子(O₂^-·)阴性细胞仅有很低的荧光强度，超氧阴离子阳性细胞有较强的绿色荧光。
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