产品目录

本试剂盒是采用一种基于MDA和TBA反应产生红色产物的显色反应，随后通过比色法用于对血浆、血清、尿液、动植物组织或细胞裂解液中MDA进行定量检测，广泛用于脂质氧化(lipid peroxidation)水平检测，丙二醛在较高温度及酸性环境中可与TBA发生反应形成红色的MDA-TBA加合物，MDA-TBA加合物在535nm处有最大吸收，据此可以通过比色法进行检测，另外MDA-TBA加合物也可以在535nm被激发产生最大发射波长553nm，据此也可以进行荧光检测。该试剂盒仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。

动物或植物细胞发生氧化应激(oxidative stress)时，会发生脂质氧化，丙二醛(Malondialdehyde,MDA)是一种生物体脂质氧化的天然产物，一些脂肪酸氧化后逐渐分解为一系列包括MDA在内的复杂化合物，此时通过检测MDA的水平即可检测脂质氧化的水平，因此MDA的测定被广泛用作脂质氧化的指标。生物体内的一些其它生化反应也会产生MDA，例如thromboxane synthase也可以催化产生，但只要在测定时设置适当对照即可观察到脂质氧化水平的变化。

• 生理盐水或PBS
  
• 离心机、离心管或96孔板、光分光光度计或酶标仪、水浴锅或恒温箱

• 上述低温试剂避免反复冻融，以免失效或效率下降。
  
• 参考取样量：
  

  样本类型	取样量
  血清、血浆、尿液	0.1mL
  低密度脂蛋白悬液	0.1～0.2mL
  食用油	0.03mL
  肝脏、心肌、肌肉等	0.1～0.2mL(5%或10%匀浆)

• 测定样品吸光度值较低时，可将水浴延长至80min，但应同时延长，以免造成批间差异。
  
• 待测样本如不能及时测定，应置于-20℃保存，4天内稳定。
  
• 避免使用EDTA、枸橼酸、氟化钠、草酸等抗凝剂。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
  
• 试剂开封后请尽快使用，以防影响后续实验效果。

• 准备样品：
  
  • 血清、血浆、尿液、脑脊液样品：从待测样本中分离出的血清或血浆不应有溶血，直接检测，如超过线性范围，用生理盐水或PBS稀释后检测。
    
  • 组织、细胞等样品：组织或细胞可以使用PBS或RAPI裂解液等进行匀浆或裂解，匀浆或裂解组织时组织重量占匀浆液或裂解液的比例应为10%；对于细胞，每10⁶个细胞使用0.1mL裂解液或匀浆液，匀浆或裂解后4℃ 8000～12000g离心10min，取上清用于后续测定。匀浆或裂解等样品制备步骤宜在冰浴或4℃条件下进行操作，样品准备完毕后可以用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，以便于后续计算单位蛋白重量组织或细胞内MDA含量。
• 配制TBA工作液：称取适量TBA，用TBA稀释液配制成浓度为0.68％的TBA工作液；例如取68mg TBA用10mL TBA稀释液配制，最终浓度即为0.68%的TBA工作液，TBA工作液需完全溶解后再使用，可以加热到60℃促溶，并可通过反复剧烈Vortex促溶。
  
  • 配制好的TBA工作液4℃避光保存，至少1个月内有效。
• 稀释系列标准品：取适量MDA标准品(1mM)，用恰当溶液稀释至1、2、5、10、20μM。
  
  • 待测样品为血清、血浆时，标准品宜用生理盐水稀释；待测样品由匀浆液、裂解液、PBS获得时，标准品宜用相同溶液稀释，其原则是保证空白管、标准管、测定管具有可比性。
    
  • 如果进行简易快速检测，标准品直接稀释10μM。
    
  • 配制好的MDA标准品4℃避光保存，至少3个月内有效。
• 配制MDA检测工作液：临检测前，根据待测定的样品数(含对照)，参考下表新鲜配制适量的MDA检测工作液。
  

  成分(mL)	1次	10次	20次
  TBA工作液	0.75	7.5	15
  抗氧化剂	0.031	0.31	0.62
  MDA检测液	0.075	0.75	1.5
  MDA分离液	2.25	22.5	45
  总体积	3.106	31.06	62.12

• MDA加样：
  
  • 在离心管或其它适当容器内加入0.08mL适当溶液作为空白对照。
    
    • 待测样品为血清、血浆时，标准品宜用生理盐水稀释；待测样品由匀浆液、裂解液、PBS获得时，标准品宜用相同溶液稀释，其原则是保证空白管、标准管、测定管具有可比性。
  • 加入0.08mL上述不同浓度系列标准品用于制作标准曲线。
    
    • 如果进行简易快速检测，直接加入浓度为10μM的标准品。
  • 加入0.08mL样品用于测定。
    
  • 随后加入3mL MDA检测工作液。
    
  • 可参考下表设置检测反应体系，依次加入试剂：
    

    成分(mL)	空白管	标准管	测定管
    匀浆液、裂解液、PBS、生理盐水等	0.08	－	－
    标准品	－	0.08	－
    待测样品	－	－	0.08
    MDA检测工作液	3	3	3

  • 混匀，加盖，95℃水浴煮沸40min，加热时务必注意避免液体暴沸溅出。
    
    • 如果使用加热块(Heat block)进行加热注意用重物压紧离心管盖。
      
    • 如果用沸水浴，则需用可把盖子锁死的离心管或螺旋盖离心管，或用Parafilm封住离心管口，用针头刺一小孔。
      
    • 最方便和准确的加热方法是使用带有热盖并可以加热金属浴。
• MDA测定：水浴或流水冷却至室温，3000r/min离心15min或4000r/min离心10min，取上清，其颜色为黄色至棕红色，蒸馏水调零，比色杯光径应为1cm，分光光度计测定535nm处空白管、标准管、测定管的吸光度，如果不方便也可以测定530～540nm之间的吸光度，分别记为A_空白、A_标准、A_测定。

• 如果进行简易快速检测，直接以10μM标准品进行计算，获得MDA的摩尔浓度。
  
  • 简易快速血清、血浆、尿液等液体样品中MDA含量计算公式：

    MDA浓度(μM)＝	A测定－A空白	×10
    	A标准－A空白

    
    
  • 简易快速细胞、组织样品中MDA含量计算公式：

    MDA浓度 (μmol/g)	＝	A测定－A空白	×10	×	1
    		A标准－A空白			蛋白质浓度(mg/mL)

• 如果需要精确计算，以MDA标准品浓度为横坐标，以对应的吸光度为纵坐标，制作标准曲线，根据标准曲线计算处MDA提取液的浓度；对于固体状组织，可以通过单位重量的蛋白含量或组织重量等来表示最初样品中的MDA含量，例如μmol/g蛋白或组织。