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本试剂盒可用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清、尿液等样品中内源性的TRAP活性。仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。

酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)分布极广泛，遍布各种组织，主要存在于细胞的溶酶体内，所以常作为溶酶体标志酶。溶酶体外的酸性磷酸酶存在于内质网和胞质内，各种动物中的酸性磷酸酶各有不同，酸性磷酸酶的适宜pH值为4.5～5.5；存在于正常人肺泡巨噬细胞和白血病人脾脏的抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistnt acid phosphatase，TRAP)均在细胞滤泡中，并不是释放入血液，血液中的TRAP绝大多数来源于破骨细胞，因此可以通过测量血液中的TRAP了解破骨细胞的功能状态，几乎被认为是是机体破骨活性的唯一血液指标，TRAP是一种糖基化的含金属蛋白酶，在破骨细胞(osteoclast)和破软骨细胞(chondroclast)中高表达，在活化的巨噬细胞和神经元中也有表达。

利用p-nitrophenyl phosphate(pNPP)为一种常用的磷酸酶显色底物，在酸性条件下可在ACP的作用下生成p-nitrophenol (p-NP)；在碱性条件下p-NP呈黄色，黄色越深说明ACP活性越高，反之则酶活性越低，在400～415nm处有最大吸收；在适量的酒石酸存在的情况下进行ACP活性检测，得到的ACP活性就是TRAP的活性，根据p-NP的生成量即可计算出TRAP的活性水平。

• PBS或生理盐水
  
• 离心机、离心管、水浴锅或恒温箱、96孔板、酶标仪

• 待测样品中不能含有磷酸酶抑制剂，同时需避免反复冻融。
  
• 如果待测样品体积较少，可减少样品加样量，以ACP Assay Buffer补至30μL。
  
• 如果无法检测405nm，亦可检测400～415nm范围内吸光度。
  
• 建议每次测定时都最好作标准曲线，以使标准更准确，另外标准品避免反复冻融。
  
• 如果没有酶标仪，也可以使用普通的分光光度计测定，但应考虑根据比色杯的最小检测体积，尽量采用小体积的比色杯。
  
• 所测样品的含量高于标准曲线的上限，应用ACP Assay Buffer稀释样品后重新测定。
  
• 配制1支显色工作液后应当日用完，因此请注意适当多准备一些样品一起检测。
  
• p-nitrophenol溶液对人体有害，反应终止液有腐蚀性，请小心操作。
  
• 如果希望进行酶活性的绝对定量，进行酶反应时应精确计时，此时推荐采用孵育30min或更长时间，以减小操作过程中的时间误差。
  
• 待测样品中抗酒石酸酸性磷酸酶活性较低时，可适当延长孵育时间至30min。

• 准备样品：
  
  • 血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于该试剂盒的测定，尿液通常也可以直接用于测定，-20℃冻存，用于TRAP的检测。
    
  • 细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如果有必要可用PBS或生理盐水进行适当匀浆，一般细胞数量在10⁶以上，组织应在100mg以上，3000～4000g离心取上清，-20℃冻存，用于TRAP的检测。
    
  • 植物样品：取适量的植物组织加入少量PBS或生理盐水，充分捣碎或研磨，静置30min，用纱布或滤纸过滤，4000g离心20min，留取上清液并测量体积，-20℃冻存，用于TRAP的检测。
    
  • 高活性样品：如果样品中含有较高活性的TRAP，可以使用ACP Assay Buffer、PBS或生理盐水稀释后再行检测。
• 配制显色工作液：取出1支pNPP，恢复至室温后溶解于2.5mL ACP Assay Buffer，混匀，冰上预冷备用，新配制的显色工作液应在6h内用完。
  
• 配制系列标准品：取出p-nitrophenol(10mM)恢复至室温，离心机10000rpm离心5min，按p-nitrophenol(10mM)∶ACP Assay Buffer=1∶19的比例混合，使浓度达到0.5mM，-20℃冻存备用；按下表继续稀释：
  

  成分(μL)	1	2	3	4	5	6
  p-nitrophenol(0.5mM)	4	8	16	24	32	40
  ACP Assay Buffer	36	32	24	16	8	0
  p-nitrophenol含量(μM/4μL)	0.002	0.004	0.008	0.012	0.016	0.02

• TRAP加样：按按照下表设置空白孔、标准孔、空白孔，溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡；如果样品中的TRAP活性过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定，样品的检测最好能设置平行孔。
  

  成分(μL)	空白孔	标准孔	测定孔
  ACP Assay Buffer	4	—	—
  系列标准品(1～6号)	—	4	—
  待测样品	—	—	4
  显色工作液	40	40	40
  Tartrate Solution	5	5	5

• TRAP测定：轻轻混匀，37℃孵育25～30min，每孔加入160μL Stopping Solution终止反应；以空白调零，酶标仪测定405nm处标准管、测定管的吸光度。

• 系列标准品(1～6号)浓度(即p-NP含量)0.002、0.004、0.008、0.012、0.016、0.02μM为横坐标，以对应的标准孔吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，根据测定孔的吸光度在标准曲线上查得待测样品p-NP的生成量。
  
• 酸性磷酸酶活性单位的定义：在pH值4.8 37℃条件下，每分钟水解pNPP显色底物产生1μM p-NP所需的酸性磷酸酶的量定义为一个酶活力单位，根据酶活性定义，计算出样品中的抗酒石酸酸性磷酸酶活性。
  
  TRAP酶活性(μM/min)=待测样品p-NP生成量/孵育时间