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无机磷检测试剂盒(米吐尔钼蓝比色法)利用无机磷在酸性条件下与钼酸铵结合生成磷钼酸铵，后者被米吐尔还原成蓝紫色的复合物，通过分光光度计测定650nm处吸光度，根据公式计算出无机磷含量。

血清中的无机磷(Inorganic phosphorous)主要由H₂PO₄^-和HPO₄^2-两种磷酸根阴离子组成，上述阴离子在不同的pH环境下能快速相互转换。在pH7.4血清中两种磷酸根阴离子浓度比例为1:4，在酸中毒环境下二者浓度约为1:1，在碱中毒环境下二者浓度比例为1:9，在pH4.5尿液中浓度比例为100:1。WHO推荐的常规检测方法为比色法，我国卫生部临检中心推荐的常规方法为硫酸亚铁钼蓝比色法和米吐尔钼蓝比色法。

• 配好的钼酸铵溶液和米吐尔溶液应尽快使用，放置过久会导致正常血清液产生轻度浑浊，如试剂变蓝则不能使用。
  
• 如果样品浓度过高，应用蒸馏水稀释后重测，结果乘以稀释倍数。
  
• 生成蓝色的深浅与pH、时间和温度有密切关系，需仔细控制显色条件。
  
• 本法的线性范围为1～35μg/mL。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
  
• 本试剂盒仅用于科研，不宜用于临床诊断或其他用途。

• 制备样品(选做)：
  
  • 血浆、血清样品：血浆、血清按照常规方法制备，可以直接用于本试剂盒的测定，-20℃冻存，用于Pi的检测。
    
  • 细胞或组织样品：取恰当细胞或组织进行匀浆，低速离心取上清，-20℃冻存，用于Pi的检测。
    
  • 高浓度样品：如果样品中含有较高浓度的Pi，可以蒸馏水稀释。
    
  • 选做：样品准备完毕后可以用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，以便于后续计算单位蛋白重量组织或细胞内的Pi含量。
• 配制磷标准工作液：取适量的磷标准(1mg/mL)，按磷标准(1mg/mL)∶标准品稀释液=1∶99的比例稀释，即获得磷标准工作液(10μg/mL)，-20℃冻存，用于Pi的检测。
  
• 配制钼酸铵溶液：将钼酸铵粉末和钼酸铵稀释液按0.3g∶50mL的比例混合，充分溶解，不好溶解时可采取超声助溶。配好的钼酸铵溶液应4℃避光保存，1个月有效。
  
• 配制米吐尔溶液：将50mg米吐尔溶解于25mL去离子水中，再将米吐尔水溶液和米吐尔稀释液按1∶9的比例充分混合。配好的米吐尔溶液应4℃避光保存，1个月有效。
  
• Pi加样：按照下表设置空白管、标准管、测定管，溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡，小心混匀。如果样品中的无机磷浓度过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定，样品的检测最好能设置2平行管，求平均值。
  

  加入物(mL)	空白管	标准管	测定管
  ddH2O	0.5	—	—
  磷标准工作液(10μg/mL)	—	0.5	—
  待测样品	—	—	0.5
  钼酸铵溶液	0.5	0.5	0.5
  米吐尔溶液	0.5	0.5	0.5
  沸水浴煮沸30min，各管加去离子水1mL，水中冷却至室温。

• Pi测定：比色杯光径1.0cm，以空白调零，分光光度计650nm处测定各管吸光度(即为A_标准、A _测定)。

• 血清、血浆中无机磷计算公式：
  
  磷＝(A_测定/A_标准)×0.323×N(mmol/L)＝(A _测定/A _标准)×10×N(mg/L)
  
  
• 组织中磷计算公式：
  
  磷(mmol/mg)＝(A_测定/A_标准)×0.323×N/c