产品目录

本制品是百奥莱博公司基于乳酸脱氢酶微板法开发的，专门用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清等样品中内源性的丙酮酸含量的试剂盒。

在NADH存在条件下，乳酸脱氢酶(LDH)催化丙酮酸氧化，生成乳酸和NAD⁺，在弱碱性条件下平衡偏向丙酮酸氧化为乳酸的方向驱动反应，通过酶标仪测定340nm处NADH吸光度的下降速率，计算出丙酮酸含量。

丙酮酸(Pyruvic acid，PA)又称2-氧代丙酸，是参与整个生物体基本代谢的中间产物之一，可通过乙酰辅酶A和三羧酸循环实现体内糖、脂肪和氨基酸间的互相转化，丙酮酸在三大营养物质的代谢联系中起着重要的枢纽作用；丙酮酸和乳酸是糖无氧代谢的产物，科研工作者常将二者一起研究，并用二者的比值推算循环衰竭的程度，丙酮酸检测可采用乳酸脱氢酶催化法、二硝基苯肼法等。二硝基苯肼法是比较古老的方法，生成有色物质，易于观察，但易受α-酮酸的干扰，特异性差，操作烦琐，目前首选方法是乳酸脱氢酶催化法。

• 本法适用于自动分析仪，分别测定管和标准管的吸光度升高速率，计算乳酸的浓度；如果采用自动分析仪，该120T试剂盒可检测约100次。
  
• 配制好的PA显色液，4℃保存，36h有效。
  
• 配制好的PA-LDH显色液，4℃保存，24h有效。
  
• 如果没有酶标仪也可以使用分光光度计测定，我们推荐采用分光光度计，以使操作系统误差减小到最少；一次不应检测过多样品，以免因为时间误差而导致结果差异较大。
  
• 抗凝剂用肝素钠-氟化钠较好，抗凝血样品置于冰浴中送检，尽快分离出血浆等。
  
• 草酸抗凝剂对LDH有一定的抑制作用。
  
• 采用乳酸脱氢酶法检测丙酮酸时，一般不建议采用微板法，这是由于手工操作差异较大，尤其是该法对操作时间要求极其严格，操作难以标准化、统一化，检测结果不稳定。
  
• 试剂开封后请尽快使用，以防影响后续实验效果。
  
• 本试剂盒仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。

• 准备样品：
  
  • 血浆、血清、尿液及其他体液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于该试剂盒的测定，尿液通常也可以直接用于测定，-20℃冻存。
    
  • 细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如果有必要需进行适当匀浆，低速离心取上清，-20℃冻存，用于PA的检测。
    
  • 高浓度样品：如果样品中含有较高浓度的PA，可以使用原有的裂解液或PBS等进行稀释，如鸡血清、血浆可稀释5～10倍后检测。
• 配制标准品工作液：取丙酮酸标准1支，准确加入丙酮酸标准稀释液1mL，充分混匀，即配制成丙酮酸标准(100mmol/L)，4℃保存备用。临用前，按丙酮酸标准(100mmol/L)：丙酮酸标准稀释液=1：199的比例混合，即为标准品工作液-丙酮酸标准(0.5mmol/L)；4℃避光保存，24h有效。
  
• 配制PA显色液：取一支NADH加蒸馏水1mL溶解，-20℃保存，7d有效。临用前，按PA Assay Buffer：NADH水溶液=50：1的比例混合，即为PA显色液，4℃保存，36h有效。
  
• 配制PA-LDH显色液(仅适用于自动分析仪)：取配制好的PA显色液9.6mL与LDH Solution 0.15mL混匀，即为PA-LDH显色液；4℃避光保存，24h有效。
  
• 酶标仪测定：按照下表设置空白孔、标准孔、测定孔，溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡；如果样品中的PA浓度过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定，样品的检测最好能设置平行孔。
  

  成分(μL)	空白孔	标准孔	测定孔
  蒸馏水	24	—	—
  待测样品(血清、血浆、体液等)	—	—	24
  丙酮酸标准(0.5mmol/L)	—	24	—
  PA显色液	256	256	256
  充分混匀，蒸馏水调零，于340nm处读取空白孔、标准孔、测定孔的吸光度，分别记为A空白1、A标准1、A测定1。
  LDH Solution	4	4	4
  室温孵育1min，酶标仪立即测定340nm吸光度，分别为A空白2、A标准2、A测定2，此后每隔1min读1次吸光度，直至读数稳定，分别为A空白x、A标准x、A测定x。

• 自动分析仪测定：样品中的PA浓度过高，可以减少样品用量或稀释后再进行测定，样品的检测最好能设置平行管；根据实验室的自动分析仪性能设置参数如下供参考：
  

  温度	37℃	延迟时间	30s
  pH	7.4	检测时间	120s
  波长	340nm
  待测样品/丙酮酸标准(0.5mmol/L)体积		25μL
  PA-LDH显色液		275μL

  分别检测待测样品管吸光度的下降速率(ΔA_u/min)和标准管吸光度的下降速率(ΔA_s/min)。

• 酶标仪比色计算公式：
  丙酮酸(mmol/L)={(ΔA_测定-ΔA_空白)/(ΔA_标准-ΔA_空白)}×0.5
  也可根据NADH毫摩尔吸光度计算：
  丙酮酸(mmol/L)=(ΔA_测定-ΔA_空白)×0.284×D/(6.22×0.024)
  ΔA_测定=A_测定1-A_测定x
  ΔA_空白=A_空白1-A_空白x
  ΔA_标准=A_标准1-A_标准x
  D=稀释倍数
  0.284=反应液的总体积(mL)
  6.22=NADH毫摩尔吸光度
  0.024=待测样品体积(mL)
  换算公式：丙酮酸(mg/dL)=丙酮酸(mmol/L)×8.8
  
• 自动分析仪计算公式：
  血清、血浆、尿液、脑脊液丙酮酸(mmol/L) ={(ΔA_u/min)/(ΔA_s/min)}×0.5
  组织丙酮酸(mmol/g) ={(ΔA_u/min)/(ΔA_s/min)}×{(0.5/待测样品蛋白浓度(g/L)}