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丙酮酸检测试剂盒(二硝基苯肼比色法)可用于检测植物、细胞或组织、血清等样品中内源性的丙酮酸含量，尤其适用植物样品丙酮酸含量的检测。

在酸性条件下，丙酮酸与二硝基苯肼反应，生成丙酮酸-二硝基苯腙复合物，后者经氧化呈棕红色，通过分光光度比色法测定520nm处吸光度，据此通过与标准曲线对比可以计算出PA水平。

• 所加试剂顺序不可颠倒，先加丙酮酸标准液或待测液，再加1×组织匀浆液，最后加1×PA Assay Buffer。
  
• 配制的丙酮酸标准(60μg/mL)应4℃避光保存，24h有效。
  
• 组织匀浆液有腐蚀性，应小心操作。
  
• 健康成年人空腹静脉全血丙酮酸含量为3～9μg/mL。
  
• 如果没有分光光度计，也可以使用酶标仪测定，检测样品量会相应增加。
  
• 标准曲线的各点应分布均匀，范围适中。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
  
• 试剂开封后请尽快使用，以防影响后续实验效果。
  
• 本试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

• 配制1×组织匀浆液：取10mL 3×组织匀浆液加入20mL蒸馏水即成。
  
• 配制1×PA Assay Buffer：取10mL 1.5×PA Assay Buffer加入5mL蒸馏水即成。
  
• 准备样品：
  
  • 血清、尿液及其他体液样品：血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，尿液通常也可以直接用于测定，-20℃冻存。
    
  • 组织样品：称取2g组织样品置于匀浆器中，再加入2mL 1×组织匀浆液仔细研磨，振摇提取，静置，取上清液4000rpm离心，取上清液，用1×组织匀浆液定容至4mL，-20℃冻存，用于PA的检测。
    
  • 植物材料：称取2g植物材料置于匀浆器中，再加入2mL 1×组织匀浆液仔细研磨，振摇提取，静置，取上清液4000rpm离心10min，取上清液，用1×组织匀浆液定容至4mL，-20℃冻存，用于PA的检测。
    
  • 高浓度样品：如果样品中含有较高浓度的PA，可以使用原有的裂解液或PBS等进行稀释，如鸡血清可稀释5～10倍后检测。
• 配制标准品工作液：
  
  • 如果检测血清、尿液等样品，按取丙酮酸标准(6mg/mL)∶蒸馏水=1∶99的比例配制，使浓度达到60μg/mL；
    
  • 如果检测组织样品，按丙酮酸标准(6mg/mL)∶1×组织匀浆液=1∶99的比例配制，使浓度达到60μg/mL。
  • 检测血清、尿液等样品时，按下表操作：
    

    加入物(ml)	1	2	3	4	5	6
    丙酮酸标准(60μg/mL，蒸馏水配制)	0.03	0.07	0.1	0.2	0.4	0.6
    蒸馏水	0.87	0.98	0.9	0.8	0.6	0.4
    丙酮酸浓度(μg/mL)	2	4	6	12	24	36

  • 检测组织样品时，按下表操作：
    

    加入物(mL)	1	2	3	4	5	6
    丙酮酸标准(60μg/mL，匀浆液配制)	0.03	0.07	0.1	0.2	0.4	0.6
    1×组织匀浆液	0.87	0.98	0.9	0.8	0.6	0.4
    丙酮酸浓度(μg/mL)	2	4	6	12	24	36

• PA加样：按照下表设置空白管、标准管、测定管，溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡。如果样品中的PA浓度过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定，样品的检测最好能设置平行管。
  
  • 检测血清、尿液等样品时，按下表操作：
    

    加入物(ml)	空白管(血清等)	标准管	测定管
    蒸馏水	0.9	—	—
    蒸馏水稀释后的各丙酮酸标准	—	0.9	—
    待测样品	—	—	0.9
    苯肼显色液	0.3	0.3	0.3
    充分混匀
    PA Assay Buffer	1.5	1.5	1.5

  • 检测组织样品时，按下表操作：
    

    加入物(mL)	空白管(组织等)	标准管	测定管
    组织匀浆液	0.9	—	—
    匀浆液稀释后的各丙酮酸标准	—	0.9	—
    待测样品	—	—	0.9
    苯肼显色液	0.3	0.3	0.3
    充分混匀
    PA Assay Buffer	1.5	1.5	1.5

• PA检测：混匀静置，其中空白管呈淡黄色，标准孔依次呈不同程度的棕红色。用分光光度计520nm，以空白管调零，比色杯光径1cm，读取标准管、测定管的吸光度(记为A _标准、A _测定)。