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总蛋白检测试剂盒(双缩脲比色法)多用于人或动物血清、血浆、组织等样本中的总蛋白含量测定，双缩脲反应的原理是在呈蓝色的碱性硫酸铜溶液存在的情况下，肽键与铜离子结合，生成蓝紫色的化合物，此化合物在540nm的吸光度与肽键的数量呈正比例关系，因此可计算出蛋白质的含量，双缩脲法测蛋白浓度兼容性亦很好，不受大部分样本中其他成分的影响，但易受铜离子螯合剂的影响，另外对于血清总蛋白的双缩脲分析，胆红素、脂类、血红蛋白、葡聚糖具有一定干扰作用，双缩脲法在5～160mg/mL浓度范围内有较好的线性关系。

• 待测样品(血清、血浆、组织)、生理盐水(0.9%NaCl)或PBS
  
• 离心管或小试管、水浴锅或恒温箱、分光光度计、比色杯、匀浆器或研钵

• 蛋白标准粉末溶解于蛋白标准配制液后，即获得蛋白标准原液，该原液中含有防腐剂，不影响后续检测，该蛋白标准原液-20℃长期保存。
  
• 待测蛋白和蛋白标准加入双缩脲试剂后，如果发现检测效果不佳，可以室温放置1h或60℃放置15min，颜色会随着时间的延长不断加深。
  
• 测定标准曲线时发现随着标准品浓度的增加吸光度或颜色没有明显变化，可能的原因是样品中含有铜离子螯合剂。
  
• 蛋白浓度低于20mg/mL时，颜色反应呈不明显的蓝色；当大于40mg/mL时，即可呈现明显的蓝紫色反应。
  
• 该试剂盒的线性范围是5～160mg/mL，样品蛋白浓度应大于1mg/mL，以20mg/mL以上为宜；如需测定低浓度蛋白样品(1mg/mL)，请选用BCA蛋白定量试剂盒或微量BCA蛋白定量试剂盒。
  
• 该试剂盒反应生成的蓝紫色的化合物的吸光度，与试剂批次、pH值、反应温度有关。
  因此建议，每次测定都做标准对照。
  
• 氨基酸和二肽不发生双缩脲反应，三肽、寡肽和多肽与铜离子的双缩脲复合物，呈粉红色-紫红色，与蛋白质的双缩脲反应结果不同。
  
• 如果没分光光度计，也可以使用酶标仪测定，使用酶标仪测定蛋白浓度时，每个试剂盒可以测定的样品数量会显著增加。
  
• 检测中发现所有孔都呈暗紫色，可能原因是样品含有还原剂，应适当透析或稀释样品。
  
• 试剂开封后请尽快使用，以防影响后续实验效果。
  
• 该试剂盒仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。

• 取0.5mL蛋白标准配制液或稀释液加入到80mg蛋白标准中，充分溶解后即配制成蛋白标准溶液(160mg/mL)，配制后可立即使用，溶解后的蛋白标准溶液应-20℃保存，亦可根据需要进行稀释，如稀释至40mg/mL。特别提示：待测蛋白溶解于什么样的稀释液中，蛋白标准也宜溶解于什么样的稀释液中，例如待测蛋白溶解于蔗糖溶液中，亦取蛋白标准溶解于蔗糖溶液中，常用0.9%NaCl或PBS作为总蛋白标准品的稀释液。
  
• 样本处理：血清、血浆样本，直接取40μL检测；对于组织样本，按组织质量(g)∶生理盐水(ml)=1∶9比例，加入9倍体积的生理盐水，冰浴下匀浆后2500g离心10min，取上清液并补生理盐水至10mL待检。
  
• TP加样：按照下表设置空白管、标准管、测定管，溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡；如果样品浓度过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定，样品的检测最好能设置平行管。
  

  加入物(mL)	空白管	标准管	测定管
  ddH2O	0.04	－	－
  蛋白标准溶液(如40mg/mL)	－	0.04	－
  待测样品	－	－	0.04
  双缩脲试剂	2	2	2

  • 当遇到浑浊或溶血样本时，可设“样本空白管”：取0.04mL待测样品加入2mL双缩脲空白试剂即为“样本空白管”，以双缩脲空白试剂调零，读取“样本空白管”的吸光度，用测定管的吸光度减去“样本空白管”的吸光度后的净吸光度，计算总蛋白浓度。
• TP测定：混匀，37℃孵育10min，比色杯光径1cm，以空白管调零，用分光光度计测定540nm处各管的吸光度，记为A标准、A测定，如无540nm，510～562nm之间的波长也可。