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本试剂盒将PMA与qPCR技术相结合，形成了PMA-qPCR这一新颖检测方法，用于活细菌的筛选，为细菌活性检测提供了有效的方法。目前该法已在多种细菌菌株以及酵母、真菌、病毒和寄生虫中得到验证。

本试剂盒包含PMA染料、基于SYBR Green染料的qPCR混合液及uidA基因的引物混合液。染料的最佳用量和可处理的样品数量可能因样品类型而异。复杂样品的处理，如粪便或土壤，可能会需要优化样品稀释度、染料浓度和光处理时间。稀释样品的处理，如水测试，可能需要在染料处理前进行过滤或浓缩。

PMA是一种高亲和性的DNA结合染料，尤其与双链DNA，该染料本身具有微弱的荧光，但与核酸结合后可以发出更为明亮的荧光。PMA具有细胞膜不可渗透性，因此可选择性地修饰膜受损的死细胞的DNA。PMA修饰的DNA经蓝光（~464nm）光解后，PMA上的光反应性叠氮基转化为高反应性氮烯自由基，与DNA结合位点附近的任何烃部分反应形成稳定的共价氮碳键，从而导致永久性DNA修饰。该修饰过程会使DNA不溶，且在后期的基因组DNA提取过程中与细胞碎片一起丢失。残留在溶液中未结合的PMA，在强光照射下与水分子反应分解成无交联活性的羟胺化合物，使其不能再共价结合DNA。

组分	规格
PMA(20mM in H2O)	100μL
2×SYBR qPCR Super mix	2mL
引物混合物(uidA，5μM)	400μL

保存：-20℃，避光。

引物序列：
For：5’-CGGTGATATCGTCCACCCAG-3’
Rev：5’-TGGATCGCGAAAACTGTGGA-3’

• 光源（用于PMA修饰DNA后的光解步骤）
  
• 细菌基因组DNA提取试剂盒

• 本活菌检测试剂盒根据细胞膜通透性区分死菌和活菌。许多杀死细菌的方法会导致细胞膜受损，因此与本试剂盒兼容。但有些方法，如紫外线照射，可能不会立即导致细胞膜破裂。因此，在选择本试剂盒之前，需先进行文献检索和预实验确定本试剂盒是否适用于您选择的细菌类型和杀伤方法。
  
• PMA处理完细菌后需要进行光解，以使染料与死细胞DNA共价结合。光解操作可以使用蓝色或白色光源。一般来说，灯越亮，光解步骤的效率就越高。非LED灯（如卤素灯）可能会加热您的样本并对分析产生负面影响，照射时需要使用冰块对样品降温处理。
  
• 样本可以在光解后冷冻保存。若在进行PMA处理光解之前冷冻样本可能会损坏细胞膜并产生假阴性结果。如需在检测之前冷冻样本，建议先进行预实验。
  
• PMA的部分作用机制是通过沉淀从样本中去除PMA共价修饰的DNA；因此，在提取基因组DNA时，需使用相同体积的基因组DNA洗脱液，进行体积归一化处理。阳性对照可以使用活细胞的基因组DNA。
  
• 为了验证PMA在测试样本中的有效性，可对比同处理样本-/+PMA之间的Ct (dCt)变化。
  
• 使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验。
  
• 试剂盒组分中含有荧光染料，使用及保存过程中注意避光。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• 吸取10μL大肠杆菌菌液于液体LB培养基，在细菌培养箱中培养大肠杆菌过夜或更长时间至对数生长期（OD600≈1.0)；
  注：培养时间根据实验调整。
  
• 取活的大肠杆菌两份，每份400μL，置于干净离心管中；
  
• （建议）制备死的大肠杆菌。若需要死的大肠杆菌作为对照，可将活的大肠杆菌放入水浴锅中95℃，5min，或58℃加热3h，即可获得死的大肠杆菌。死的大肠杆菌的后续操作同活的大肠杆菌；
  
• 两份活的大肠杆菌，一份不用PMA处理，一份用25μM PMA处理（处理不同类型或不同来源细菌的最适PMA浓度需查阅相关文献）；
  
• 将PMA处理的样本室温置于摇床上，避光孵育10min，使染料与样本充分混匀；
  
• 将样品曝光，可以使用蓝色或白色光源，照射时间需自行摸索。例如，可用60 W的蓝光灯，照射15min。
  注：
  ① 若使用卤素灯，我们建议将PMA处理的样本管放在距离光源20cm处的冰块上。冰块应放在透明托盘中。调整光源使其直接指向样品，光解5～15min；
  ② 若直接用环境中获取的细菌进行实验，由于环境样本的复杂性或浑浊度，需适当延长光解时间。
  
• 处理和未处理的活的大肠杆菌5000×g，离心10min，去上清；
  
• 根据样本类型选择合适的基因组DNA提取试剂盒，洗脱DNA时，各组样本使用相同的洗脱体积。
  注：DNA提取步骤参考所用试剂盒的说明书。PMA的部分作用机制是通过沉淀从样品中去除PMA结合的DNA；因此，在提取基因组DNA时，各组应使用相同体积的基因组DNA洗脱液，进行体积归一化处理（死菌和活菌提取基因组DNA量不一致，因此两者浓度相差明显）。
  
• 按如下体系制备反应混合液：
  

  成分	用量	终浓度
  2×SYBR qPCR Super mix	10μL	1×
  引物混合物(uidA，5μM)	2μL	0.5μM
  模板	适量	-
  ddH2O	补足至20μL	-

  
  注：
  ① 商用DNA提取试剂盒提取的DNA，qPCR模板以2μL作为起始优化体积；
  ② 模板体积不得超过最终反应体积的10%；
  ③ 模板浓度：gDNA做模板时，通常1～10ng即可；
  ④ PCR引物的终浓度通常为0.4μM，可以得到较好的结果，反应性能较差时，可以在0.2～1μM范围内调整引物浓度。
  
• 轻轻涡旋混匀反应混合液，转移固定体积至PCR管。
  
• 测试程序
  

  程序	温度	时间	循环
  预变性	95℃	120s	1
  变性	95℃	5s	40
  退火	60℃	15s
  延伸	72℃	30s

  
  注：
  ① 延伸时间根据使用仪器自行调整；
  ② mix中的Taq酶可在2min内完成激活，但基因组DNA可能需要更长的变性时间，此时可增加变性时间，具体变性时间可根据样本类型进行调整。
  
• （可选）数据分析
  使用活细菌和死细菌作为对照，分析计算样本中活细胞数。建议开始PMA qPCR活细菌检测前，先验证引物及PCR程序是否合适。
  
• 死、活细菌对照dCt计算
  
  • qPCR结束后，使用仪器软件计算每个样本的Ct值；
    
  • 通过计算每个对照细菌的dCt的方式，判断PMA是否成功抑制了死细菌DNA的扩增，计算如下：
    dCt_活 = Ct_{(活，PMA处理)} - Ct_{(活，PMA未处理)}
    dCt_死 = Ct_{(死，PMA处理)} - Ct_{(死，PMA未处理)}
    
  • 活细菌的dCt期望值接近于0 ±1，这表明PMA不会影响活细胞DNA的扩增；
    
  • 死细菌的dCt期望值大于4（dCt为4表示减少了约16倍，即去除了94%的死细菌DNA；dCt为8表示减少了约250倍，即去除了99.6%的死细菌DNA）；
    
  • 死细菌的dCt取决于许多因素，包括：菌株系/细胞类型；细菌被杀死方式；PMA使用浓度；扩增序列长度。
• （可选）活细菌占比计算
  如果死、活细菌对照结果正常，可以进入样本中活细菌占比计算。
  
  • 计算样本的dCt值：
    dCt_样本 = Ct_{(样本，PMA处理)} - Ct_{(样本，PMA未处理)}
    
  • 转换dCt值为活细菌比例：
    PMA抑制倍数= 2^{（样本dCt）}
    活细菌% = 100/PMA抑制倍数
• （可选）计算活细菌的绝对数量
  如果想计算样本中活细菌的绝对数量^☆，需要用已知数量的目标菌的基因组DNA制作标准曲线。建议稀释的几组基因组浓度在qPCR分析体系的范围内。
  
  • 用合适的基因组进行qPCR，并以Ct值为纵坐标，细胞数为横坐标。计算R²值判断线性度，并显示斜率和y轴截距。
    
  • 计算实验样本的拷贝数：
    Ct =斜率*细胞数+ y轴截距（y = mx + b）
    细菌数样本= （Ct–y轴截距）/斜率
    注^☆：纯化过程中活细菌DNA未损失。

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