产品货号：
BTN15-62820
中文名称：
肠出血性大肠杆菌O157:H7血清型(EHEC)荧光定量PCR试剂盒(探针法)
英文名称：
Enterohemorrhagic E. coli qPCR Kit(Probe Method)
产品规格：
50次
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本产品是以探针法荧光定量PCR技术为基础开发的专门检测E.coli O157:H7的试剂盒。
肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic E.coli、EHEC)就是能引起人的出血性腹泻和肠炎的一群大肠埃希氏菌，其主要血清型为O157:H7，它可以引起出血性腹泻、肠炎，严重可致死，老年人和儿童易感染。它的感染具有暴发流行的特点，具有强烈的致病性和致死性。此外，其感染剂量极低，不足10个细菌即可致病，因此快速检测E.coli O157:H7具有重要意义。荧光定量PCR是检测传染性疾病的主流技术。
保存：-20℃，有效期一年。
一、稀释标准曲线样品(以101～106拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)。
由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。
二、样品DNA的制备
三、Probe qPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)
四、数据处理
相关搜索：肠出血性大肠杆菌O157:H7血清型(EHEC)荧光定量PCR试剂盒(探针法)，Enterohemorrhagic E. coli qPCR Kit(Probe Method)
肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic E.coli、EHEC)就是能引起人的出血性腹泻和肠炎的一群大肠埃希氏菌，其主要血清型为O157:H7，它可以引起出血性腹泻、肠炎，严重可致死，老年人和儿童易感染。它的感染具有暴发流行的特点，具有强烈的致病性和致死性。此外，其感染剂量极低，不足10个细菌即可致病，因此快速检测E.coli O157:H7具有重要意义。荧光定量PCR是检测传染性疾病的主流技术。
- 即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
- 引物和探针经过优化，灵敏性高。
- 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
- 特异性高，引物是根据E.coli O157:H7高度保守区设计，in silico分析发现其不会跟其他非E.coli O157:H7的DNA发生交叉反应。
- 本产品足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。
- 既可用于定性，也可用于定量。用于定量时线性范围至少5个数量级。
- 本产品只能用于科研。
| 组分 | 规格 |
| 2×Probe qPCR MagicMix | 0.5mL |
| 荧光PCR专用模板稀释液 | 1mL |
| 超纯水 | 1mL |
| E.coli O157:H7探针法qPCR引物-探针混合液 | 150μL |
| E.coli O157:H7 PCR阳性对照(1×107拷贝/μL) | 50μL |
保存：-20℃，有效期一年。
一、稀释标准曲线样品(以101～106拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)。
由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。
- 标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。
- 用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同)。
- 在6号管中加入5μL 1×107拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×106拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
- 换枪头，在5号管中加入5μL 1×106拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×105拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
- 换枪头，在4号管中加入5μL 1×105拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×104拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
- 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品DNA的制备
- 如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用上步所得第4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。
- 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数细菌DNA提取试剂盒兼容。
三、Probe qPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)
- 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于PCR阳性对照(可以直接用第6步所得的第4号管稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
- 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：
成分 样品管
N+2个PCR阴性
对照管曲线样品管
(1～6管)2×Probe qPCR
MagicMix10μL 10μL 各10μL E.coli O157:H7探针法qPCR引物-探针混合液 3μL 3μL 各3μL N+2个待测DNA模板 7μL 不加 不加 超纯水 不加 7μL 不加 第6步所得标准曲线样品 不加 不加 各7μL - 盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
过程 温度 时间 预变性 95℃ 4min PCR反应
(40个循环)95℃ 15sec 60℃ 60sec(采集FAM通道的荧光信号)
四、数据处理
- 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
- 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于35。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35～40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。
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