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本公司开发了简单快捷的布鲁氏杆菌属通用染料法荧光定量PCR检测试剂盒。


布鲁氏杆菌(Brucella spp.)是一种细胞内寄生小球杆状菌，革兰氏染色阴性，主要感染动物，牛、羊、猪、狗以及骆驼、鹿等动物，主要是通过接触感染的动物或者吃被感染的食物以及实验室接触等方式传播给人类。能引起人和多种动物的急性和慢急性疾病，被感染的人和动物表现为流产及不孕不育等症状，因此布鲁氏杆菌属通用的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用。

1. 即开即用，用户只需要提供细菌样品。
   
2. 根据布鲁氏杆菌属共同的保守序列设计的专一性引物，能检测常见的羊、牛、猪、犬布鲁氏杆菌，与其他细菌无交叉反应。
   
3. 灵敏度可以达到几百拷贝/反应。
   
4. 一管式荧光定量PCR检测，避免后续污染。
   
5. 本试剂盒足够50次20μL反应体系的荧光定量PCR。
   
6. 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。

组分	规格
2×qPCR MagicMix	500μL
荧光PCR专用模板稀释液	1mL
布鲁氏杆菌属通用染料法qPCR引物混合液	100μL
布鲁氏杆菌属通用染料法qPCR阳性对照(1×108拷贝/μL)	50μL

保存：-20℃，有效期一年。


一、稀释PCR阳性对照(以10²～10⁷拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的DNA片段作为阳性对照。

1. 标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。
   
2. 用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液(最好用带芯枪头，下同)。
   
3. 在7号管中加入5μL 1×10⁸拷贝/μL的阳性对照，充分震荡1分钟，得1×10⁷拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
   
4. 换枪头，在6号管中加入5μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁶拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
   
5. 换枪头，在5号管中加入5μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照到5号管中，充分震荡1分钟，得1×10⁵拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
   
6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

7. 如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步制备的PCR阳性对照的第4号(浓度为1×10⁴拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝)或第5号(浓度为1×10⁵拷贝/μL，10μL相当于10万拷贝)再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。如果每次制备需要200μL起始病毒样品，则PC和NC的起始体积也必须是200μL。
   
8. 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数细菌DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的柱式细菌DNA提取试剂盒。本试剂盒免费赠送20次核酸释放剂试用装，其使用手册可从本公司网站，www.bjbalb.com通过搜索产品名称核酸释放剂或产品货号BTN61202下载。

三、设置qPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

9. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于PCR阳性对照(用第4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
   
10. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：
    

    成分	样品管 N+2个	PCR阴性 对照管	PCR阳性对照管 (2～7管)
    2×qPCR MagicMix	10μL	10μL	各10μL
    布鲁氏杆菌属通用qPCR引物混合液	2μL	2μL	各2μL
    自备10×ROX(见注)	2μL	2μL	各2μL
    N+2待测样品DNA模板	6μL	-	-
    超纯水	-	6μL	-
    第7步所得PCR阳性对照稀释液(2～7号)	-	-	各6μL

    注：仅ABI7500、7700和7900仪器需要使用ROX作为对照，其他荧光PCR仪器(如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000和LightCycler480)不需要使用ROX，则用水替代。
    
11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR(具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化)。
    

    过程	温度	时间
    预变性	95℃	10min
    PCR反应 (40个循环)	95℃	15sec
    	60℃	1min(采集FAM通道的荧光信号)
    按仪器预设程序进行熔解曲线分析

四、数据处理

12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
    
13. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35～40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。

相关搜索：布鲁氏杆菌属荧光定量PCR试剂盒(染料法)，Brucella spp. qPCR Kit(SYBR)