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本公司开发了致泻性大肠杆菌(致泻性大肠埃希氏菌)通用染料法荧光定量PCR试剂盒。


能够引起肠道内急性腹泻的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌(Diarrheagenic
Escherichia coli，DEC)根据致病性的不同，致泻性大肠埃希菌被分为五种，即肠致病性大肠埃希氏菌(EPEC)、肠产肠毒素大肠埃希氏菌(ETEC)、肠侵袭性大肠埃希氏菌(EIEC)、肠出血性大肠埃希氏菌(EHEC)和粘附性肠埃希氏菌(EAEC)。我国发生的食物中毒事件中，细菌性食物中毒的人数最多，占总中毒人数的42.8％，其中致泻性大肠埃希氏菌是引起人体以腹泻症状为主的全球性疾病的常见病原菌，在我国引起感染性腹泻的发病率居所有传染病之首，因此快速检测致泻性大肠杆菌(致泻性大肠埃希氏菌)通用具有重要意义。

1. 即开即用，用户只需要提供DNA模板。
   
2. 引物根据致泻性大肠杆菌(致泻性大肠埃希氏菌)通用专一区设计，特异性高。
   
3. 荧光定量PCR检测，比常规PCR更加灵敏。
   
4. 一管式闭管操作，降低了交叉污染。
   
5. 本试剂盒足够50次20μL反应体系的荧光定量PCR。
   
6. 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。

组分	规格
2×qPCR MagicMix	500μL
荧光PCR专用模板稀释液	1mL
致泻性大肠杆菌(致泻性大肠埃希氏菌)通用染料法qPCR引物混合液	100μL
致泻性大肠杆菌(致泻性大肠埃希氏菌)通用染料法qPCR阳性对照(1×108拷贝/μL)	50μL

保存：-20℃，有效期一年。


一、稀释PCR阳性对照(以10²～10⁷拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)注意：由于阳性对照浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的DNA片段作为阳性对照。

1. 标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。
   
2. 用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液(最好用带芯枪头，下同)。
   
3. 在7号管中加入5μL 1×10⁸拷贝/μL的阳性对照，充分震荡1分钟，得1×10⁷拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
   
4. 换枪头，在6号管中加入5μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁶拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
   
5. 换枪头，在5号管中加入5μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照到5号管中，充分震荡1分钟，得1×10⁵拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
   
6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

7. 如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL PCR阳性对照的10000倍稀释的(稀释后浓度为1×10⁴拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝，可以将10μL原液加入到990μL自备TE溶液中，充分混匀，此为100倍稀释液。再取10μL此稀释液加入到990μL自备TE溶液中，充分混匀，此为10000倍稀释液)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。制备所得成为样品DNA。
   
8. 用自选方法纯化N+2个样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼容。

三、设置qPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

9. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于PCR阳性对照(用第4号阳性对照稀释液，浓度为14810拷贝/μL)。下面只描述定量分析的步骤，定性分析只是把6个标曲反应缩减成1个，其余不变。
   
10. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：
    

    成分	样品管 N+2个	PCR阴性 对照管	PCR阳性对照管 (2～7管)
    2×qPCR MagicMix	10μL	10μL	各10μL
    致泻性大肠杆菌(致泻性大肠埃希氏菌)通用染料法qPCR引物混合液	2μL	2μL	各2μL
    自备10×ROX(见注)	2μL	2μL	各2μL
    N+2待测样品cDNA模板	6μL	-	-
    自备超纯水	-	6μL	-
    第7步所得PCR阳性对照稀释液(2～7号)	-	-	各6μL

    注：仅ABI7500、7700和7900仪器需要使用ROX作为对照，其他荧光PCR仪器(如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000和LightCycler480)不需要使用ROX，则用水替代。
    
11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR(具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化)。
    

    过程	温度	时间
    预变性	95℃	5min
    PCR反应 (40个循环)	95℃	15sec
    	60℃	1min，(采集SYBR通道的荧光信号)
    按仪器预设程序进行熔解曲线分析

四、数据处理

12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品cDNA浓度的log值，再推算出其浓度。
    
13. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35～40之间，则重复一次。若重复结果Ct值小于40，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。

相关搜索：致病性大肠杆菌荧光定量PCR试剂盒(染料法)，Pathogenic E.coli qPCR Kit(SYBR)