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幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)是一种革兰氏染色阴性细菌，常寄生在胃粘膜组织中，感染率相对较高。幽门螺旋杆菌感染主要引起胃炎、消化道溃疡、淋巴增生性胃淋巴瘤等，严重者会导致胃癌。幽门螺旋杆菌可以感染人和多种动物，严重影响人和动物健康，因此快速检测幽门螺旋杆菌具有重要意义。

1. 即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
   
2. 引物经过优化，灵敏度高，最低检测限可达100拷贝/反应。
   
3. 提供阳性对照，用于制备标准曲线和排除假阴性实验。
   
4. 特异性高，引物根据幽门螺旋杆菌基因组高度保守区设计，不会跟其它生物的DNA发生交叉反应。
   
5. 本制品足够50次20μL体系的染料法荧光定量PCR反应。
   
6. 既可用于定性检测，也可用于定量检测。用于定量检测时，线性范围至少5个数量级。
   
7. 本制品只能用于科研。

1. 标记6个离心管，分别为6、5、4、3、2、1。
   
2. 用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头(下同)。
   
3. 在6号管中加入5μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡混匀1分钟，得到1×10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
   
4. 换枪头，在5号管中加入5μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡混匀1分钟，得到1×10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
   
5. 换枪头，在4号管中加入5μL 1×10⁵拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡混匀1分钟，得到1×10⁴拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
   
6. 依次重复上面的操作得到6个稀释度的标准曲线样品，放冰上待用。

7. 如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL第6步所得的第4号稀释液(1×10⁴拷贝/μL)再加上一定量的水使总体积跟核酸纯化试剂盒所要求的起始样本体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。
   
8. 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数样品DNA提取试剂盒兼容，也可使用本公司的免提取核酸释放剂。

9. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于PCR阳性对照(用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
   
10. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：
    

    成分	样品管 N+2个	PCR阴性 对照管	曲线样品管 (1～6管)
    2×SYBR qPCR MasterMix	10μL	10μL	各10μL
    幽门螺旋杆菌染料法qPCR引物混合液	2μL	2μL	各2μL
    N+2个待测DNA模板	8μL	不加	不加
    超纯水	不加	8μL	不加
    第6步所得标准曲线样品稀释液(1～6号)	不加	不加	各8μL

11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
    

    过程	温度	时间
    预变性	95℃	10分
    PCR反应 (35个循环)	95℃	15秒
    	60℃	1分(采集SYBR通道的荧光信号)
    溶解曲线分析		按qPCR仪器手册执行

12. 通过溶解曲线分析的结果排除无效数据。有Ct值，但溶解曲线分析得到的Tm值跟阳性对照Tm不一样的样品(包括对照和待测样品)，归为假阳性，数据无效，不予以分析。溶解曲线分析得到的Tm值跟阳性对照的Tm值一致的，为有效Ct。
    
13. 如果两种阴性对照的溶解曲线所得Tm值跟阳性对照的Tm值一样，说明环境或试剂可能有过去的PCR扩增产物污染，则此次实验无效，需要解决污染问题再进行实验。
    
14. 如果两种阴性对照(样品制备阴性对照和PCR阴性对照)是假阳性，可以继续分析其它样品有效数据。
    
15. 对定量检测，以阳性对照样品的浓度的log值为横轴，以有效Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的有效Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再换算出待测样品的DNA浓度。
    
16. 对定性检测，则有有效Ct值的为阳性，无有效Ct值的为阴性。