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马链球菌马亚种(Streptococcus equi subspecies equi)为链球菌属C群成员，原产地为中国。马链球菌马亚种菌体呈球形或椭圆形，革兰氏染色阳性，无运动性，不形成芽孢，但能形成荚膜，是一种能够引起马腺疫的重要病原体。马腺疫是一种马属动物的急性接触性传染病，可引起2岁以下马匹发热、咽炎、头颈淋巴结肿大、化脓及流脓性鼻液，严重可造成马匹死亡。该病是马属动物最常发的传染病之一，其发病急，传播快，流行广泛等特点，导致了世界马养殖业的严重经济损失。因此快速检测马链球菌马亚种具有重要的意义。

1. 即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
   
2. 产品经过精心优化，分析灵敏性能到达100拷贝/反应。
   
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
   
4. 特异性高，引物是根据马链球菌马亚种DNA高度保守区设计，分析发现它能检测马链球菌马亚种，不会跟除此之外的其他生物的DNA发生交叉反应。
   
5. 本制品足够50次20μL体系的常规PCR反应。
   
6. 本制品只能用于定性实验，不能用于定量实验。
   
7. 本制品只能用于科研。

1. 如果有N个样品，必须设置N+2个提取反应，多出的两个中一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用试剂盒提供的PCR阳性对照(10⁴拷贝/μL，本试剂盒提供)10μL加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟核酸制备试剂盒所要求的起始样品体积一样)。可以直接用水作为制备的阴性对照。
   
2. 用自选方法纯化上述N+2个样品的DNA。本试剂盒跟市场上大多数样品DNA提取试剂盒兼容。也可以选用本公司的相关的核酸提取试剂盒。

3. 标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的DNA样品，额外增加的两个管一个用于PCR阳性对照，另一个用于PCR阴性对照。按照下表在各PCR管中加入下列成分：
   

   成分	N+2个 样品管	PCR 阴性对照	PCR 阳性对照
   2×PCR MasterMix	各10μL	10μL	10μL
   马链球菌马亚种PCR引物混合液	各2μL	2μL	2μL
   制备的N+2个DNA样品	各8μL	不加	不加
   超纯水	不加	8μL	不加
   马链球菌马亚种PCR阳性对照(104拷贝/μL)	不加	不加	8μL

4. 上机进行PCR，PCR反应参数：
   

   过程	温度	时间
   预变性	95℃	10min
   PCR反应 (30个循环)	95℃	30sec
   	55℃	60sec
   	65℃	60sec
   终延伸	72℃	10min

5. 取10μL扩增产物进行常规琼脂糖电泳，检测扩增效果，由于扩增产物较短，建议用1.5%～2.0%的琼脂糖凝胶。
   
6. 阳性样品预期得到的扩增产物长度为187bp。如果两个阴性对照(样品制备阴性对照或PCR阴性对照)有此扩增产物，说明环境污染，则整个实验无效，不需要分析实验结果。如果所有样品和PCR阳性对照均无此扩增产物，则说明有系统性的问题(试剂，设备，程序，操作等)，需要重复并排查原因。
   
7. 如果没有上述两种情况，则实验有效，可以分析样品的扩增结果。N+2个样品中扩增产物的判断为阳性，无则判定为阴性。