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本制品是一种快速、便捷的用于3D培养的细胞球或类器官等凋亡或坏死细胞的细胞核染色的溶液。仅需染色10分钟就可在荧光显微镜下观察到凋亡或坏死细胞中非常明亮的细胞核绿色荧光染色。

YO-PRO-1是一种对正常动物细胞膜没有通透性而对于凋亡细胞的细胞膜有通透性的DNA绿色荧光染料，常用于细胞凋亡与坏死的检测。YO-PRO-1是一种非细胞膜穿透性的并对DNA具有高亲和力的羰花青单体绿色荧光染料，在没有与DNA结合的时候基本上没有荧光，而与DNA结合后可以发出明亮的绿色荧光。在细胞凋亡发生时，细胞膜通透性发生改变，此时YO-PRO-1可以进入细胞内与DNA结合，发出明亮的绿色荧光，因此常使用本荧光染料用于分析和鉴定凋亡细胞。需要注意的是YO-PRO-1也能染色细胞膜缺乏完整性的坏死细胞，因此需要和对坏死细胞特异性荧光染色的PI进行双染才能有效判定细胞凋亡。

YO-PRO-1作为一种细胞凋亡检测的荧光探针，可以应用于大多数的哺乳动物细胞，包括贴壁细胞和悬浮细胞，与传统的Annexin V-FITC检测方法相比，检测准确性和灵敏度相当。YO-PRO-1检测的是细胞凋亡时细胞膜通透性的改变，而Annexin V-FITC检测的是细胞凋亡时细胞膜上的磷脂酰丝氨酸从细胞膜的内膜翻转至外膜。

YO-PRO-1的相关信息如下：

别名	恶唑黄；Oxazole yellow；YP1
CAS号	152068-09-2
分子式	C24H29I2N3O
分子量	629.32
光谱特性	结合DNA后的最大激发光波长为491nm，最大发射波长为509nm

• 适用范围广：本制品可用于常规方法培养出的3D细胞球或类器官，包括超低吸附细胞培养板、Matrigel包被的平板、琼脂糖包被的平板、细胞悬滴培养板等。
  
• 使用便捷：整个检测过程仅需约10～30分钟即可完成。3D细胞球经凋亡诱导等处理后，仅需加入本制品避光孵育10分钟即可进行荧光检测。

组分	10mL	50mL	200mL
3D培养凋亡坏死细胞核染色液(YP1)	10mL	50mL	200mL
说明书	1份

保存：-20℃，避光，有效期1年。

• 本制品反复冻融可能会降低染色效果，为保证最佳使用效果，请尽量避免反复冻融，第一次解冻后可以适当分装保存。
  
• 细胞球在外力的作用下容易变形或分散，PBS洗涤及换液等过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。
  
• 不同种类的细胞球对凋亡诱导剂的耐受可能存在一定的差别，3D细胞球经凋亡诱导后，形态可能会发生一些变化，在染色前可以镜下观察细胞球的形态，可以酌情考虑是否选择形态比较完整的细胞球进行染色分析。
  
• 本制品浓度经过百奥莱博的优化，确保可以满足凋亡细胞染色及常规染色的需要。如需使用特定浓度的YO-PRO-1，请选购凋亡与坏死细胞绿色荧光探针(YO-PRO-1)。
  
• 荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽量当天完成检测。
  
• YP1对人体有刺激性，操作时请小心，并注意适当防护以避免直接接触人体或吸入体内。

本步骤以96孔板，每孔接种100μL细胞为例，如使用其它类型的多孔板，各试剂使用量请按照相应比例进行换算。

• 3D细胞的准备：在96孔3D培养板中每孔接种100μL细胞，细胞的接种量根据具体的实验方案，例如培养天数、需要的3D细胞球状体的大小等确定，按照3D细胞培养方案培养细胞，并按照实验设计进行一定的处理。96孔3D培养板推荐使用3D细胞培养板包被液、3D细胞培养包被试剂盒包被的U形底96孔板，或直接使用GoldBalb超低吸附96孔板(YTC4962或YTC4961)、超低吸附黑色透明底96孔板等。
  
  • 为达到最佳的使用效果，具体的细胞球培养时间、药物等干预时间可以根据细胞种类、具体的实验需求等进行调整。例如，对于HCT-116细胞，通常接种培养48小时形成较为紧实的细胞球后进行干预和染色效果较好。
• 3D细胞YO-PRO-1染色：
  
  • 小心去除原有细胞培养液。
    
    • 3D细胞球通常位于在培养板或培养皿等培养器皿的底部，培养板在对着光线时能看到孔内针尖大小的乳白色细胞球，吸除孔内液体时须尽量避开细胞球以免将细胞球吸走。可以根据孔内液体的体积将移液器调至合适的量程，例如需要吸除的液体体积为100μL，将200μL移液器的量程调整到50～70μL，避开细胞球从液体边缘缓慢、分次吸除。孔内加入液体时，沿着孔壁小心、缓慢加入，避免破坏或吹散3D细胞球。
  • 每孔加入100μL By3D YO-PRO-1染色液，在适宜于细胞培养的温度避光孵育10分钟。
    
    • 为达到最佳的染色效果，具体染色时间可以根据细胞种类、培养天数、细胞球状大小等进行调整。
• 荧光照片拍摄：染色结束后，可以无须洗涤，即可在荧光显微镜下观察。染色结束后，加入适量的PBS小心洗涤细胞1～2次，染色效果更佳。

图1.本制品对于3D培养的HCT-116细胞的染色效果图。5000个HCT-116细胞在使用3D细胞培养包被试剂盒包被的U形底96孔板中培养48小时，不同浓度Camptothecin诱导细胞球凋亡过夜，然后加入By3D YO-PRO-1染色液染色10分钟。结果显示，By3D YO-PRO-1染色液对于药物诱导凋亡的3D细胞染色效果清晰、明亮，且3D细胞球内部的凋亡更严重一些，同时无药物处理组无明显YO-PRO-1荧光染色。实际检测效果会因细胞株、实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。
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