本制品是用细胞凋亡荧光探针Annexin V-mCherry联合死细胞绿色荧光探针SYTOX Green来同时检测细胞球或类器官中凋亡细胞和坏死细胞的一种细胞凋亡检测试剂盒。本试剂盒可快速、便捷地用于3D培养的细胞球或类器官中凋亡细胞和坏死细胞染色。仅需染色15分钟，就可在荧光显微镜下观察到非常明亮的凋亡和坏死细胞中细胞膜红色荧光染色，和坏死细胞中细胞核绿色荧光染色。本试剂盒适用于荧光显微镜、荧光酶标仪及其它荧光检测系统。
本试剂盒检测的是Annexin V-mCherry红色荧光和SYTOX Green的绿色荧光，Annexin V-mCherry荧光蛋白的最大激发光波长为587nm，最大发射光波长为610nm；SYTOX Green插入DNA后最大激发光波长为504nm，最大发射光波长为523nm。
Annexin V选择性结合磷脂酰丝氨酸。磷脂酰丝氨酸主要分布在细胞膜内侧，即与细胞浆相邻的一侧。在细胞发生凋亡的早期，不同类型的细胞都会把磷脂酰丝氨酸外翻到细胞表面，即细胞膜外侧。磷脂酰丝氨酸暴露到细胞表面后会促进凝血和炎症反应。而Annexin V和外翻到细胞表面的磷脂酰丝氨酸结合后可以阻断磷脂酰丝氨酸的促凝血和促炎症反应活性。
SYTOX Green是一种非细胞膜渗透性的花菁荧光染料，不能穿过具有生物活性的细胞质膜，只能穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋形成SYTOX Green-DNA复合物，荧光强度增加500倍以上，从而产生明亮的绿色荧光，因此SYTOX Green仅能对死细胞染色，从而被用来区分正常细胞与坏死细胞。
Annexin V-mCherry相比藻红蛋白(PE)标记的Annexin V，激发光谱更窄，不会像PE那样在495nm左右产生红色荧光，非常适合与其它绿色荧光一同检测。
正常细胞不会被Annexin V-mCherry和SYTOX Green所染色，凋亡细胞和坏死细胞都会被Annexin V-mCherry所染色，坏死细胞的细胞核被SYTOX Green染成明亮的绿色荧光。有报道称，凋亡中晚期细胞的细胞核被SYTOX Green染成较弱的绿色荧光。
- 适用范围广：本试剂盒可用于常规方法培养出的3D细胞球或类器官，包括超低吸附细胞培养板、Matrigel包被的平板、琼脂糖包被的平板、细胞悬滴培养板等。
- 使用便捷：整个检测过程仅需约15～30分钟即可完成。3D细胞球经凋亡、坏死等诱导处理后，将本试剂盒中的By3D Annexin V-mCherry (40×)和By3D SYTOX Green Staining Solution (100×)按照相应比例用By3D Annexin V-mCherry Binding Buffer制成By3D Annexin V-mCherry/SYTOX Green检测工作液，避光孵育15分钟，就可进行后续的荧光显微镜拍照等荧光检测和分析。
| 组分 | 20T | 50T |
| By3D Annexin V-mCherry(40×) | 50μL | 125μL |
| By3D Annexin V-mCherry Binding Buffer | 2mL | 5mL |
| By3D SYTOX Green Staining Solution (100×) | 20μL | 50μL |
保存：-20℃，避光，有效期1年。
- 本制品反复冻融可能会降低染色效果，为保证最佳使用效果，请尽量避免反复冻融，第一次解冻后可以适当分装保存。
- 细胞球在外力的作用下容易变形或分散，PBS洗涤及换液等过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。
- 不同种类的细胞球对凋亡或坏死诱导剂的耐受可能存在一定的差别，3D细胞球经凋亡或坏死诱导后，形态可能会发生一些变化，在染色前可以镜下观察细胞球的形态，可以酌情考虑是否选择形态比较完整的细胞球进行染色分析。
- 如果有细菌或真菌污染，会严重影响检测效果。
- 染色后宜尽快检测，时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。
- 荧光物质均易发生淬灭，在进行荧光观察时，尽量缩短观察时间，同时在操作和存放过程中也尽量注意避光保存。
- 如果细胞收集过程中使用了胰酶，需注意设法去除残留的胰酶。残留的胰酶会消化并降解By3D Annexin V-mCherry导致染色失败。
本步骤以96孔板，每孔接种100μL细胞为例，如使用其它类型的多孔板，各试剂使用量请按照相应比例进行换算。
- 3D细胞的准备：在96孔3D培养板中每孔接种100μL细胞，细胞的接种量根据具体的实验方案，例如培养天数、需要的3D细胞球状体的大小等确定，按照3D细胞培养方案培养细胞，并按照实验设计进行一定的处理。96孔3D培养板推荐使用3D细胞培养板包被液、3D细胞培养包被试剂盒包被的U形底96孔板，或直接使用超低吸附96孔板(货号：YTC4961或YTC4962)、超低吸附黑色透明底96孔板等。
- 为达到最佳的染色效果，具体的细胞球培养时间、药物等干预时间可以根据细胞种类、具体的实验需求等进行调整。例如，对于HCT-116细胞，通常接种培养48小时形成较为紧实的细胞球后进行干预和染色效果较好。
- 3D细胞Annexin V-mCherry/SYTOX Green染色：
- By3D Annexin V-mCherry/SYTOX Green检测工作液的用量：对于6、12、24、96孔板，每孔By3D Annexin V-mCherry/SYTOX Green检测工作液的用量分别为0.5～1mL、200～500μL、100～200μL和50～100μL。
- By3D Annexin V-mCherry/SYTOX Green检测工作液的配制：如下表所示，按照每孔需要100μL By3D Annexin V-mCherry/SYTOX Green检测工作液的量，用By3D Annexin V-mCherry Binding Buffer稀释配制适量的By3D Annexin V-mCherry/SYTOX Green检测工作液。
样品数 10个样品 50个样品 100个样品 By3D Annexin V-mCherry (40×) 25μL 125μL 250μL By3D SYTOX Green Staining Solution (100×) 10μL 50μL 100μL By3D Annexin V-mCherry Binding Buffer 965μL 4.825mL 9.65mL By3D Annexin V-mCherry/SYTOX Green检测工作液 1mL 5mL 10mL - 配制好的By3D Annexin V-mCherry/SYTOX Green检测工作液必须一次使用完毕，不能冻存。
- By3D Annexin V-mCherry/SYTOX Green检测工作液中的Annexin V-mCherry和SYTOX Green的最终浓度可以根据不同细胞系和实验体系通过预实验进行优化。Annexin V-mCherry和SYTOX Green的工作浓度通常为0.5～2×，推荐使用浓度为1×。
- 染色：小心吸除原有细胞培养液，沿着孔壁缓慢加入100μL By3D Annexin V-mCherry/SYTOX Green检测工作液，在适宜于细胞培养的温度避光孵育15分钟。
- 为达到最佳的染色效果，具体染色时间可以根据细胞种类、培养天数、细胞球状大小等进行调整。
- 任何液体吸除或加入的过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。3D细胞球通常位于在培养板或培养皿等培养器皿的底部，培养板在对着光线时能看到孔内针尖大小的乳白色细胞球，吸除孔内液体时须尽量避开细胞球以免将细胞球吸走。可以根据孔内液体的体积将移液器调至合适的量程，例如需要吸除的液体体积为100μL，将200μL移液器的量程调整到50～70μL，避开细胞球从液体边缘缓慢、分次吸除。孔内加入液体时，沿着孔壁小心、缓慢加入，避免破坏或吹散3D细胞球。
- By3D Annexin V-mCherry/SYTOX Green检测工作液的用量：对于6、12、24、96孔板，每孔By3D Annexin V-mCherry/SYTOX Green检测工作液的用量分别为0.5～1mL、200～500μL、100～200μL和50～100μL。
- 荧光检测：
- 荧光显微镜检测：孵育结束后，小心去除孔内染色液，沿着孔壁缓慢加入适量的PBS洗涤细胞球1次并更换为完全培养液，随后在荧光显微镜下观察荧光染色效果。注意整个过程均需注意避光操作。
- 任何液体吸除或加入的过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。
- 荧光酶标仪检测：孵育结束后，小心吸除孔内染色液，沿着孔壁缓慢加入适量的PBS洗涤细胞球1次并更换为完全培养液，随后用荧光酶标仪检测(Annexin V-mCherry为红色荧光，Ex/Em=587/610nm；SYTOX Green为绿色荧光，Ex/Em=504/523nm)。通过对比对照组两种荧光探针的RFU，可以计算出凋亡细胞与坏死细胞的相对比例关系。
- 任何液体吸除或加入的过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。
- 荧光显微镜检测：孵育结束后，小心去除孔内染色液，沿着孔壁缓慢加入适量的PBS洗涤细胞球1次并更换为完全培养液，随后在荧光显微镜下观察荧光染色效果。注意整个过程均需注意避光操作。
图1．本试剂盒联合3D细胞Hoechst 33342染色液对于3D培养的HCT-116细胞的染色效果图。5000个HCT-116细胞在使用3D细胞培养包被试剂盒包被的U形底96孔板中培养48小时，100μM Camptothecin诱导细胞球凋亡、坏死过夜，然后吸除培养液后直接加入1×的By3D Annexin V-mCherry/SYTOX Green检测工作液(Hoechst 33342染色液可混合配制在一起)，染色15分钟。结果显示，By3D Annexin V-mCherry/SYTOX Green细胞凋亡检测试剂盒对于药物诱导凋亡、坏死后的3D细胞染色效果清晰、明亮，SYTOX Green染色的坏死细胞核(B、G)、Annexin V-mCherry染色的凋亡或坏死细胞膜可见明显差别(C、H)，同时Control组无明显Annexin V-mCherry和SYTOX Green荧光染色(B、C、E)，Hoechst 33342染色的细胞核总体基本一致(D、I)。实际检测效果会因细胞株、实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。
细胞凋亡(Apoptosis)是生物体发育等生命过程中普遍存在的、由基因决定的细胞主动有序的死亡方式。当细胞遇到内、外环境因子刺激时，启动基因调控的自杀保护措施，去除体内非必需细胞或即将发生特化的细胞。在这一过程中，细胞脱落离体或裂解为若干凋亡小体，并迅速被巨噬细胞或邻近细胞清除，这是一种由基因控制、高度有序的细胞自主死亡，包含一系列信号事件组成的通路。细胞凋亡失调与多种疾病有关，例如阿尔茨海默病和癌症等。
细胞凋亡通过特征性的形态学和生物化学变化而区别于坏死(Necrosis)，包括细胞皱缩、细胞核皱缩、核膜核仁破碎等等。在正常活细胞中，磷酯酰丝氨酸(PS)位于细胞膜的近细胞质面。而在凋亡细胞中，PS从质膜的内部外翻到细胞表面即细胞膜外侧，从而使PS暴露于细胞外部。在白细胞的凋亡过程中，白细胞表面的PS标记可以被巨噬细胞识别，从而最终被巨噬细胞吞噬。人血管抗凝血剂Annexin V是一种35～36kDa Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，对PS具有高亲和力。用红色荧光蛋白的mCherry标记的Annexin V染色细胞，就可以通过荧光显微镜、激光共聚焦显微镜或流式细胞仪等荧光检测设备非常简单而直接地检测到磷酯酰丝氨酸的外翻这一细胞凋亡的重要特征。需要指出的是对于坏死细胞，由于细胞膜的完整性被破坏，位于细胞膜内侧的PS也会被Annexin V-mCherry染色。
传统的细胞培养大多以二维(2D)的形式展开，但2D培养的细胞在生长方式、生长形态、分化和功能等方面都与体内生理条件下细胞的真实形态和结构存在明显差异，可能会因为细胞结构和组织形态的缺失，使实验结果的可信度降低。三维(3D)细胞培养能够更好地模拟体内细胞生存的微环境，更能代表体内组织，也能更真实的反应细胞与细胞间、细胞与基质间的相互作用，细胞对外源性和内源性刺激的应答也更接近于它们在体内的反应，3D细胞培养从而成为更有价值并更为可信的体外实验模型，能够获得与体内实验更加一致的实验结果。
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