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本制品是一种高效、便捷、灵敏的基于DNA绿色荧光染料DMAO和红色荧光染料碘化丙啶(PI)的双荧光染色法检测细菌活死的试剂盒。本试剂盒检测时，活细菌呈现绿色荧光，死细菌呈现绿色和红色两种荧光。本试剂盒可使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光酶标仪、流式细胞仪等荧光检测系统进行检测。

DMAO是一种核酸绿色荧光染料，对于革兰氏阳性和阴性细菌均适用，且既能染色活细菌，也能染色死细菌。该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，优先结合双链DNA。DMAO非常稳定，在室温下进行常规操作和保存不易降解。PI是一种非渗透性荧光染料，不能穿过具有生物活性的细胞质膜，因此对于具有完整细胞膜的细菌不能染色。而对于坏死细菌，其细胞膜的完整性丧失，PI可进入细胞核并与双链DNA结合，并嵌入细菌的DNA双螺旋形成PI-DNA复合物从而产生红色荧光，这种结合很少或几乎没有序列偏好，每4～5个碱基对插入一分子PI染料。将DMAO与PI联合使用检测细菌的活死，具有完整细胞膜的活细菌呈现绿色荧光，细胞膜受损的死细菌同时呈现绿色与红色荧光。

• 细菌染色前应去除培养基，培养基内的组分会结合DMAO与PI染料，使染色效率降低。
  
• 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
  
• 初次使用时1000×DMAO和1000×PI可适当分装后-20℃保存，以避免反复冻融。
  
• 检测缓冲液经过过滤除菌处理，在使用时须注意避免微生物污染，否则很可能严重影响染色效果。如果检测缓冲液发生浑浊等明显的微生物污染，就不能继续使用。
  
• 荧光酶标仪检测时须使用适合荧光检测的黑板或白板，推荐使用黑色96孔板或黑色透明底96孔板。

• 活死细菌染色工作液(100×)的配制：
  96孔板每孔所需活死细菌染色工作液(100×)的量为1μL，其它培养器皿的活死细菌染色工作液的用量以此类推；对于细菌悬液500～1000万细菌所需活死细菌染色工作液(100×)的量为1μL，其它细菌数的活死细菌染色工作液(100×)的用量以此类推。取适量1000×DMAO和1000×PI，使用检测缓冲液将1000×DMAO和1000×PI稀释至100×，例如取10μL 1000×DMAO和10μL 1000×PI加入80μL检测缓冲液中，混匀后即为100μL活死细菌染色工作液(100×)。
  
  • 配制活死细菌染色工作液(100×)时应注意避光，且须现配现用，不可长期保存。
    
  • 活死细菌染色工作液中DMAO和PI的最终浓度需根据不同细菌菌株和实验体系通过预实验进行优化。
• 荧光显微镜检测：
  
  • 细菌培养：在合适的液体培养基中培养细菌至对数生长期。
    
  • 细菌准备：取适量菌液，10000×g室温离心5分钟，弃上清，用生理盐水洗涤1次，然后用生理盐水将菌液浓度调整至约10⁸个细菌/mL(OD670≈0.3)。
    
  • 染色：按照每100μL菌液，加1μL染色工作液(100×)的比例混匀。37℃避光孵育15分钟。不同的细菌菌种最佳孵育时间可能有所不同，以15分钟作为初始孵育时间，后续可以根据实际染色效果对染色时间进行适当调整和优化，以得到更加理想的染色效果。
    
  • 检测：孵育结束后，取10μL的菌液滴加在载玻片上，并盖上24mm方形盖玻片，在荧光显微镜下观察染色效果。DMAO为绿色荧光，Ex/Em=503/530nm；PI为红色荧光，Ex/Em=535/617nm。本制品对于大肠杆菌DH5α菌株的荧光染色效果参考图2。
    
    • 由于细菌比较小，观察会有一定的难度，且荧光容易淬灭，须进行预实验，尽量调整好参数后再观察。
• 流式细胞仪检测：
  
  • 细菌培养：在合适的液体培养基中培养细菌至对数生长期。
    
    • 细菌培养基中含有的碎片可能会影响流式结果，建议细菌培养基0.2μm过滤处理。
  • 细菌准备：取适量菌液，10000×g室温离心5分钟，弃上清，用生理盐水洗涤1次，然后用生理盐水将菌液浓度调整至约10⁸个细菌/mL (OD670≈0.3)。再用生理盐水以1:100稀释，使最终菌液浓度为10⁶个细菌/mL。
    
  • 单染工作液(100×)的配制：使用检测缓冲液将1000×DMAO和1000×PI分别稀释至100×，例如取1μL 1000×DMAO加入9μL检测缓冲液中，混匀后即为10μL DMAO单染工作液(100×)；取1μL 1000×PI加入9μL检测缓冲液中，混匀后即为10μL PI单染工作液(100×)。
    
  • 染色：取1mL菌液，加10μL的活死细菌染色工作液(100×)比例混匀。同时取1mL菌液，加入10μL检测缓冲液，用作流式细胞仪检测时的阴性对照。另外，需要准备两管1mL细菌菌液，分别加入10μL DMAO单染工作液(100×)或10μL PI单染工作液(100×)，用于流式单染的补偿调节。37℃避光孵育15分钟。不同的菌种最佳孵育时间可能有所不同，以15分钟作为初始孵育时间，后继可以根据实际检测效果对孵育时间进行适当优化以得到最佳的效果。
    
  • 检测：孵育完成后，可以直接进行流式细胞仪检测，也可以10000×g室温离心5分钟沉淀细菌，吸净液体后每个样品加入0.5mL生理盐水重悬细胞后用流式细胞仪检测。DMAO为绿色荧光，Ex/Em=503/530nm；PI为红色荧光，Ex/Em=535/617nm。注意整个过程均需注意避光操作。染色后，将样品置于冰上，并尽量在1小时内进行流式细胞仪检测和分析。
    
    • 使用仅含缓冲液、并且未经染色的细菌菌液用于流式细胞仪的阴性对照设置。
      
    • 细菌圈门时，注意不要圈入细菌碎片，并使用DMAO或PI单染的细菌进行调节补偿。双染细菌流式检测应获得两个相对独立的细菌群：只有绿色荧光的活细菌群及绿色与红色荧光双染的死细菌群。
      
    • 由于流式检测比较灵敏，使用的荧光探针浓度可能要比荧光显微镜检测时要低，此时可根据细胞类型和实际染色情况对DMAO或PI的稀释倍数进行适当调整。
      
    • 由于细菌比较小，建议使用专门的能检测细菌的流式细胞仪。
      
    • 流式细胞仪参数的设置对于细菌的检测很关键。建议通过绿色荧光或者红色荧光对侧向散射结果图(SSC)，圈出细菌群，然后通过绿色荧光对红色荧光流式结果图展示细菌群的分布。菌活死的浓度计算可以通过绿色或者红色荧光对侧向散射流式结果图、或者绿色荧光对红色荧光流式结果图，根据实际情况选择活死菌分群最明显的结果图来进行计算。
      
    • 活死菌群的分布位置可能会因细菌种类、仪器参数设置而存在一些差别，某些点会分布于划定区域以外，须进行适当的评估和参数的调整。
• 荧光酶标仪检测细菌活死的变化：
  
  • 细菌培养：在合适的液体培养基中培养细菌至对数生长期。
    
  • 细菌准备：取适量菌液，10000×g室温离心5分钟，弃上清，用生理盐水洗涤1次；然后用生理盐水将菌液浓度调整至约10⁸个细菌/mL(OD670≈0.3)。再用生理盐水以1:100稀释，使最终菌液浓度为10⁶个细菌/mL。
    
  • 染色：按照100μL菌液/孔加入96孔板中，每孔加1μL的活死细菌染色工作液(100×)，混匀。37℃避光孵育15分钟。不同的菌种最佳孵育时间可能有所不同。以15分钟作为初始孵育时间，后继可以根据实际检测效果对孵育时间进行适当优化以得到最佳的效果。
    
  • 检测：孵育结束后，用荧光酶标仪检测RFU。DMAO为绿色荧光，Ex/Em=503/530nm；PI为红色荧光，Ex/Em=535/617nm。
• 荧光酶标仪检测细菌活死的比例：本方法通过设置细菌活死标准曲线，可计算出待测样品中活细菌与死细菌的比例。
  
  • 细菌培养：在合适的液体培养基中培养细菌至对数生长期。
    
  • 细菌活死样品准备：
    ① 取等量菌液于2支1.5mL离心管中，10000×g室温离心5分钟，弃上清，用生理盐水洗涤1次。
    ② 1支菌液加入生理盐水，为活细菌样品；另1支菌液乙醇(或异丙醇)/生理盐水混合溶液(乙醇或异丙醇:生理盐水=7:3)，为死细菌样品。用各自溶液将2支菌液样品浓度调整至约10⁸个细菌/ml (OD670≈0.3)。
    ③ 将2支样品在室温下孵育1小时，每15分钟混匀1次。
    ④ 10000×g室温离心5分钟，弃上清，用生理盐水洗涤1次，然后用相应体积的生理盐水重悬至约10⁸个细菌/mL。
    ⑤ 用生理盐水以1:100稀释，使最终菌液浓度为106个细菌/ml，备用。
    
  • 细菌活死标准品设置：如下表所示，按照对应的比率在96孔板相应孔中混合两种细菌悬液以获得所需的细菌活死标准品。
    

    孔数	活菌百分比(%)	活细菌体积(μL)	死细菌体积(μL)
    1	0	0	100
    2	10	10	90
    3	20	20	80
    4	30	30	70
    5	40	40	60
    6	50	50	50
    7	60	60	40
    8	70	70	30
    9	80	80	20
    10	90	90	10

    
    
  • 染色和检测步骤同步骤4c-4d。
    
  • 根据检测数据拟合细菌活死标准曲线。对于大肠杆菌DH5α菌株，本试剂盒检测细菌活死标准品效果参考图3。