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本产品是采用分光光度法检测细胞或组织裂解液中caspase 9酶活性或纯化的caspase 9酶活性的试剂盒。

本试剂盒是基于caspase 9可以催化底物Ac-LEHD-pNA产生黄色的pNA，从而可以通过测定吸光度来检测caspase 9的活性。pNA在405nm附近有强吸收。试剂盒中提供了caspase 9催化产生的黄色产物pNA，可以作为定量caspase 9酶活性的标准品。

• 须自备可以测定A405或A400的酶标仪或容量不超过100μL的分光光度检测杯及相应分光光度计。优先考虑测定A405，如有困难可以测定A400。
  
• Ac-LEHD-pNA需尽量避免反复冻融，请注意适当分装。
  
• 测定蛋白浓度需Bradford蛋白浓度测定试剂盒(货号：YT034)，可向百奥莱博订购。建议样品用水稀释1倍后再用Bradford法测定蛋白浓度，以降低DTT对蛋白浓度测定的干扰。
  
• pNA(中文名为4-硝基苯胺)对人体有毒，操作时请特别小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。pNA(10mM)在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可以20～25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。
  
• 本试剂盒的裂解液可以和百奥莱博的其它caspase活性检测试剂盒的裂解液通用，即本试剂盒裂解液制备的蛋白样品可以用于百奥莱博其它caspase活性检测试剂盒的检测。

• 准备工作：
  
  • 裂解液溶解后混匀并置于冰浴上备用。
    
  • 检测缓冲液溶解后混匀并置于冰浴上备用。
• 测定pNA标准曲线：
  
  • 标准品稀释液的配制：按照每0.9mL检测缓冲液加入0.1mL裂解液的比例配制适量的标准品稀释液。
    
  • 把试剂盒提供的pNA (10mM)用标准品稀释液稀释为0、10、20、50、100和200μM，作为标准品。
    
  • 每个浓度取100μL用酶标仪进行检测，或取适当量用容量不超过100μL的分光光度检测杯进行检测，测定A405。
    
  • 每一个标准品的A405减去不含pNA的空白对照的A405计算出实际的因pNA而导致的吸光度，并制作出pNA浓度相对于A405的标准曲线。pNA标准曲线可以参考图1，在0～200μM范围内存在良好的线性关系。
    
    图1．pNA标准曲线。实测数据可能因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。
• 样品的收集：
  
  • 对于悬浮细胞：把没有诱导凋亡的对照样品和诱导凋亡的样品，600g 4℃离心5分钟收集细胞，小心吸除上清，同时确保尽量没有细胞被吸除，PBS洗涤一次。同前吸尽上清后，按照每200万细胞加入100μL裂解液的比例加入裂解液（如果裂解不充分，可以把裂解液的用量提高至150或200μL），重悬沉淀，冰浴裂解15分钟。下转步骤3d。
    
  • 对于贴壁细胞：吸取细胞培养液，备用。用胰酶消化贴壁细胞，并收集至备用的细胞培养液中。600g 4℃离心5分钟收集细胞，小心吸除上清，同时确保尽量没有细胞被吸除，PBS洗涤一次。同前吸尽上清后，按照每200万细胞加入100μL裂解液的比例加入裂解液（如果裂解不充分，可以把裂解液的用量提高至150或200μL），重悬沉淀，冰浴裂解15分钟。下转步骤3d。
    
  • 对于组织样品：按照每3～10mg组织加入100μL裂解液的比例加入裂解液，在冰浴上用玻璃匀浆器匀浆。然后把匀浆液转移到1.5mL离心管中，冰浴再裂解5分钟。
    
  • 4℃ 16000～20000g离心10～15分钟。
    
  • 把上清转移到冰浴预冷的离心管中。
    
  • 立即测定caspase 9的酶活性或-70℃保存样品。同时可以取少量样品用Bradford法测定蛋白浓度，尽量使蛋白浓度达到1～3mg/ml，相当于每10μL待测样品中至少含有10～30μg蛋白。如果细胞较小，可以适当增加细胞的用量。
• Caspase 9酶活性的检测：
  
  • 取出适量的Ac-LEHD-pNA(2mM)，置于冰浴上备用。
    
  • 如下设置反应体系：
    

    成分	空白对照	样品
    检测缓冲液	40μL	40μL
    待测样品	0μL	50μL
    裂解液	50μL	0μL
    Ac-LEHD-pNA(2mM)	10μL	10μL
    总体积	100μL	100μL

    
    注意：在设置反应体系时先加检测缓冲液，再加待测样品，适当混匀，注意避免在混匀时产生气泡。随后再加入10μL Ac-LEHD-pNA(2mM)。
    
  • 加入Ac-LEHD-pNA(2mM)后混匀，注意避免在混匀时产生气泡。37℃孵育60～120分钟。发现颜色变化比较明显时即可测定A405。如果颜色变化不明显，可以适当延长孵育时间，甚至可以孵育过夜。
    
  • 样品的A405扣除空白对照的A405，即为样品中caspase 9催化产生的pNA产生的吸光度。通过同步骤1中获得的标准曲线的对比就可以计算出样品中催化产生了多少量的pNA。
    
  • 参考Chemicon公司的caspase 9酶活力单位的定义：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0nmol of the colorimetric substrate Ac-LEHD-pNA per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations。即一个酶活力单位定义为当底物饱和时，在37℃一个小时内可以剪切1nmol Ac-LEHD-pNA产生1nmol pNA的caspase 9的酶量。这样就可以计算出样品中含有多少个酶活力单位的caspase 9。说明：在本试剂盒的检测体系中，底物的起始浓度为0.2mM，此时底物是饱和的，对于许多样品而言在37℃孵育2个小时以内底物都是饱和的；对于样品中caspase 9酶活力特别高的情况，须用裂解液适当稀释样品后再进行测定。
    
  • 用Bradford法检测待测样品中的蛋白浓度(由于裂解液中含有较高浓度的DTT，不适合采用BCA法进行蛋白浓度测定)。这样就可以计算出一个样品单位重量蛋白中所含的caspase 9的酶活力单位。

• 测定出的A405过低：
  
  • 样品中蛋白含量太低，裂解样品时需设法使样品中的蛋白浓度至少达到1～3mg/ml。
    
  • 样品中激活的caspase水平很低。首先确认凋亡现象是否明显，如果凋亡比较明显并且确认该caspase是可以被激活的，可以适当调节诱导细胞凋亡的时间，希望能找到一个caspase激活比较强的时间点，这样就可以检测出该caspase的激活。可以作一时间曲线，例如诱导凋亡0、2、4、8、16和24小时，或0、1、2、4、8和16小时，或0、1、2、4、6和8小时等。具体的诱导凋亡时间需根据具体情况而定。
• 测定出的A405过高或者样品量不足：
  测定出来的A405读数过高时，可以参考下表的反应体系适当减少样品的用量；样品量不足时也可以参考下表减少样品的用量。
  

  成分	空白对照	样品
  检测缓冲液	40μL	40μL
  待测样品	0μL	xμl
  裂解液	50μL	(50-x)μl
  Ac-LEHD-pNA(2mM)	10μL	10μL
  总体积	100μL	100μL

  
  说明：其中x不超过50，其余检测方法同上面的使用说明所述。