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本试剂采用Hoechst 33342和碘化丙啶(PI)双染的方法以区分凋亡细胞和坏死细胞的试剂盒。经上述两种染料双染后，使用流式细胞仪或荧光显微镜检测时，正常细胞为弱红色荧光＋弱蓝色荧光，凋亡细胞为弱红色荧光＋强蓝色荧光，坏死细胞为强红色荧光＋弱蓝色荧光。

本试剂盒染色快速方便，可用一步法或者两步法进行染色。使用流式细胞仪检测时，无需稀释等配制过程，也无需再准备其它任何溶液。本试剂盒足够检测100个样品，每个样品的细胞数量可达10⁵～10⁶个。

细胞核荧光染料Hoechst 33342可以穿透细胞膜，嵌入双链DNA后释放蓝色荧光。对于正常细胞，其可少许进入细胞膜使其染上低蓝色。而凋亡细胞由于细胞膜通透性增强，从而使得进入凋亡细胞内的Hoechst 33342明显多于正常细胞，荧光强度比正常细胞要高。另外，细胞发生凋亡时染色质会固缩，从而使得染料能更有效和聚集的结合于DNA，并且凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受损而不能有效的将Hoechst 33342排除到细胞外使其在细胞内的积累增加，这些特征都使得凋亡细胞经染色后荧光会比正常细胞明显增强。但细胞核荧光染料PI不能穿透细胞膜完整的正常细胞或凋亡细胞，即活细胞对PI染料拒染。而对于坏死细胞，其细胞膜的完整性在早期即已丧失，可被PI染色。

组分	规格
Hoechst 33342染色液	500μL
PI染色液	500μL
细胞染色缓冲液	100mL

保存：2～8℃，避光，有效期1年。

• Hoechst 33342、PI对人体有害，请注意适当防护；
  
• Hoechst 33342、PI需避光，整个实验过程尽量避光操作；
  
• 荧光染料均存在淬灭情况，建议染色后需尽快检测；
  
• Hoechst 33342与细胞孵育时间不宜过长，一般控制在20min以内。太长容易引起该染料的发射光谱由蓝光向红光迁移，导致红色荧光和蓝色荧光比例改变。
  
• 如果用于组织样品检测，则必须把组织消化制备成单细胞悬浮液后才可以进行检测。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
  
• 本制品仅作科研用途！

• 样品准备：
  
  • 贴壁细胞：小心吸除培养液至一个无菌离心管内备用。胰酶消化细胞，加入上述培养液，吹打所有贴壁细胞，并轻轻吹散细胞，收集至离心管内，4℃，1000g离心3～5min，使细胞沉淀至管底。小心吸除上清，可留约50μL培养液，以免吸到细胞。加入约1mL预冷PBS(bjbalb，货号：60145ES76)，重悬细胞，并转移至1.5mL无菌离心管。4℃，1000g离心3～5min，使细胞沉淀至管底。小心吸除上清，可留约50 μLPBS，以免吸到细胞。轻弹离心管底适当分散细胞，避免细胞成团。
    
  • 悬浮细胞：4℃，1000g离心3～5min，使细胞沉淀至管底。小心吸除上清，可留约50μL培养液，尽量避免吸到细胞。加入约1mL预冷PBS，重悬细胞，并转移至1.5mL无菌离心管。4℃，1000g离心3～5min，使细胞沉淀到管底。小心吸除上清，可留约50μL PBS，以免吸到细胞。轻弹离心管底适当分散细胞，避免细胞成团。
• 重悬细胞：
  取上述收集好的10⁵～10⁶个细胞，加入0.8～1mL细胞染色缓冲液重悬细胞。
  
• 细胞染色：
  
  • 一步法染色：
    
    • 加入5 μLHoechst 33342染色液。
      
    • 加入5 μLPI染色液。
      
    • 轻轻混匀，冰浴或4℃孵育20～30min。
    注：尽快进行后续荧光检测
    
  • 两步法染色：
    
    • 加入5 μLHoechst 33342染色液，置于37℃孵育5～15min；
      
    • 置于冰水浴中冷却后，4℃ 1000g离心3～5min，吸除上层染色液；
      
    • 加入0.8～1mL细胞染色缓冲液重悬细胞沉淀；
      
    • 加入5 μLPI染色液，置于冰浴或4℃，孵育5～15min。
    注：尽快进行后续荧光检测
• 检测与分析
  
  • 流式细胞仪检测：Hoechst 33342用氪离子激光激发紫外光，与DNA结合后其最大激发波长为352nm，发射波长为400～500nm(最大激发波长461nm)，产生蓝色荧光；PI用氩离子激光激发荧光，与DNA结合后可用激发波长488nm(最大激发波长535nm)，发射波长大于575nm(最大激发波长617nm)，产生红色荧光，分析蓝色荧光对红色荧光的散点图或地形图。
    结果判断：
    在蓝色荧光对红色荧光的散点图上，可将细胞分为三个群：
    
    • 正常细胞：弱蓝色荧光＋弱红色荧光【Hoechst 33342+/PI+】；
      
    • 凋亡细胞：强蓝色荧光＋弱红色荧光【Hoechst 33342++/PI+】；
      
    • 坏死细胞：弱蓝色荧光＋强红色荧光【Hoechst 33342+/PI++】。
  • 荧光显微镜观察：检测前4℃ 1000g离心3～5min，沉淀细胞，用PBS洗涤一次，再涂片观察红色和蓝色荧光。
    注：对于贴壁细胞使用荧光显微镜检测，可以不收集细胞，弃培养液，之后用PBS洗涤细胞一次，弃PBS洗涤液。然后直接依次按照上述比例加入细胞染色缓冲液、Hoechst 33342染色液和PI染色液冰浴或4℃染色20～30min。染色后PBS洗涤一次，然后在荧光显微镜下观察。Hoechst 33342用氪离子激光激发紫外光，与DNA结合后其最大激发波长为352nm，发射波长为400～500nm(最大激发波长461nm)，产生蓝色荧光；PI用氩离子激光激发荧光，与DNA结合后可用激发波长488nm(最大激发波长535nm)，发射波长大于575nm(最大激发波长617nm)，产生红色荧光。

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