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线粒体膜电位荧光探针JC-10是JC-1的升级产品，同样可用于检测线粒体膜电位的变化。因JC-1虽然在许多实验中被广泛应用，但是其水溶性很差，即使在1μM浓度的条件下，JC-1也会在水的缓冲液中析出。而JC-10具有更好的水溶性，可以在某些需要高浓度染料的实验中替代JC-1。在一些细胞系中JC-10有着比JC-1更好的表现。不过，JC-10的性能表现极具细胞依赖性特征。

正常细胞内，JC-10选择性聚集在线粒体基质中形成可逆的红色荧光聚合物(Ex=540nm,Em=590nm)；不健康的线粒体由于膜电位的下降或丧失，JC-10由多聚体转变为单体形式存在于胞浆中，产生绿色荧光(Ex=490nm,Em=525nm)。JC-10不仅可用于定性检测，因颜色的变化可以非常直接的反映出线粒体膜电位的变化。也可以用于定量检测，因线粒体的去极化程度可以通过红/绿荧光强度的比例来衡量。这两种颜色的变化可以用流式细胞仪上的标准滤光器检测到，绿色荧光可用FL1通道分析，红色荧光可用FL2通道分析。除了用于流式细胞术，也可以用于荧光成像和荧光酶标板检测平台。

化学名称	5,6 -Dichloro-1,1',3,3'-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide;Enhanced JC-1;
分子式	C25H27Cl2IN4
分子量	583.34
纯度	＞95%(HPLC)
外观	红色粉末
溶解性	溶于DMSO
荧光光谱	单体形式(monomer form)：Ex=490nm,Em=525nm 聚合物形式(J-aggregate form)：Ex=540nm,Em=590nm

组分	1mg	5mg
JC-10荧光探针(2mg/mL)	1mg	-
JC-10荧光探针粉末	-	5mg

保存：-20℃，避光，溶液避免反复冻融，有效期1年。

• JC-10是光敏感性的，所有染色步骤的操作过程中避免强光接触。
  
• JC-10染色完成后，立即进行后续的结果分析非常必要；
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
  
• 本制品仅作科研用途！

一、工作液配制：

• JC-10粉末(5mg)：直接加2.5 mLDMSO到粉末内，室温颠倒混匀使其充分溶解，即得到2mg/mL(约3mM)的储存液。溶液分装成小量储存于-20℃，避光干燥，避免反复冻融。
  
• JC-10储存液(1mg in DMSO)：本品是JC-10的DMSO储存液，浓度为2mg/mL(约3mM)。使用者需要根据单次用量来分装，-20℃避光干燥，避免反复冻融。
  
• 工作液配制(现配现用)：将冻存的储存液置于室温充分融化，之后用HHBS(1×Hanks with 20mM Hepes buffer,pH7.0)或其他缓冲液(pH7～8，含0.02% Pluronic F-127)配制成10～30μM 1×工作液。涡旋混匀。
  注：对于某些细胞，在pH8情况下可能会阻止JC-10渗透入细胞。

二、JC-10染色步骤

• 荧光酶标仪
  
  • 细胞准备
    
    • 贴壁细胞：细胞养过夜使其密度达到2×10⁴～8×10⁴ cells/well/90μL(96孔板)或者5×10³～2×10⁴ cells/well/20μL (384孔板)。
      
    • 悬浮细胞：离心后重新将细胞悬浮在培养液中1×10⁵～2×10⁵ cells/well/90μL(多聚赖氨酸包被的96孔板)或者2.5×10³～5×10⁴ cells/well/20μL(多聚赖氨酸包被的384孔板)。实验前800rpm离心2分钟。注意：不同的细胞系需要根据具体情况优化凋亡实验用的最佳细胞密度。
  • 用实验药物(10μL 10×化合物)处理细胞一段时间以诱导细胞凋亡(例如，用camptothecin处理Jurkat细胞4-6h)。空白对照(只有培养基不含细胞)中加入相同量的药物。
    注：药物处理前没有必要清洗细胞。但是，如果药物对血清敏感，可在加入药物前吸掉培养基和血清因子。然后加入等量体积的HBSS溶液到孔内。或者细胞直接培养在无血清培养基内。
    
  • 加入100μL/孔(96孔板)或25μL孔(384孔板)JC-10工作液。
    
  • 37℃，5% CO₂孵育15～60min。具体孵育时间取决于细胞类型和细胞浓度。每次实验建议优化体系。
    
  • 直接进行荧光变化检测，记录Ex/Em = 500/525nm(FITC通道)和540/595nm(TRITC通道)的荧光
    值，然后计算红色荧光信号与绿色荧光信号的比值，用来判断细胞健康程度。
    (可选)或者，吸除JC-10工作液，加入100μL/孔(96孔板)或25μL/孔(384孔板)HHBS，再进行后续的荧光酶标仪检测。
• 荧光显微镜或流式细胞仪
  
  • 培养细胞过夜使其在药物处理以诱导凋亡时的密度为：5×10⁵～1×10⁶ cells/mL。选择实验药物处理细胞一段时间以诱导细胞凋亡(例如，用camptothecin处理Jurkat细胞4-6h)。
    注：进行凋亡诱导时的细胞密度建议不超过1×10⁶ cells/mL，也可根据自己的细胞类型培养至合适的密度。
    
  • 离心，去上清，每管得到1～5×10⁵细胞。
    
  • 用500μL JC-10工作液重悬细胞。
    
  • 室温孵育或37℃，5%CO₂孵育15～60min，需避光。具体孵育时间取决于细胞类型和细胞浓度。
    
  • 用荧光显微镜分别观察Ex/Em = 490/525nm(FITC通道)和540/595nm(TRITC通道)的荧光变化；或者用流式细胞仪(FL1和FL2通道进行检测)。
    (可选)或者，吸除JC-10工作液，加入100μL/孔(96孔板)或25μL/孔(384孔板)HHBS，再进行后续的荧光显微镜检测。

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