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本试剂盒用绿色荧光染料BaFluor 488(Phycoerythrin)标记的Annexin V作为探针，来检测细胞早期凋亡的发生，可用荧光显微镜、流式细胞仪或其他荧光检测设备进行检测。

本试剂盒中提供的7-AAD可用来区分存活的早期细胞和坏死或晚期凋亡细胞。7-AAD是一种核酸染料，同PI有着相似的荧光特性，但其发射光谱较PI窄，对其他检测通道的干扰更小，在多色荧光分析中是PI的最佳替代品，可与Annexin V联合使用。该染料不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但可穿透晚期凋亡细胞或者坏死细胞并与其内的DNA结合。因此将Annexin V- BaFluor 488与7-AAD联合使用时，7-AAD则被排除在活细胞(Annexin V-/7-AAD-)和早期凋亡细胞(Annexin V+/7-AAD-)之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被Annexin V-BaFluor 488和7-AAD结合染色呈现双阳性(Annexin V+/7-AAD+)。

在正常的活细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)位于细胞膜的内侧，但在早期凋亡的细胞中，PS从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V(膜联蛋白-V)是一种分子量为35～36KD的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。

• 试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 由于细胞凋亡是一个快速的过程，建议样品在染色后1小时之内进行分析。
  
• 对于贴壁细胞，消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导细胞凋亡时如有漂浮细胞，需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。处理贴壁细胞时要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞。胰酶消化时间过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜的损伤，7-AAD摄入过多；消化时间过长，细胞膜同样易造成损伤，甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-BaFluor 488的结合。消化时将胰酶铺满孔板底后，轻摇时胰酶与细胞充分接触，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段时间，待细胞间空隙增大，瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中尽量不用EDTA，EDTA会影响Annexin V与PS的结合。
  
• 如果样品来源于血液，请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS，能与Annexin V结合，从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂并低速离心(200×g)洗去血小板，然后用Annexin V结合缓冲液清洗细胞，以避免残留的EDTA会螯合Ca²⁺。
  
• 7-AAD为潜在致癌物，操作时请采取防护措施，穿防护服、戴手套等。
  
• Annexin V-BaFluor 488和7-AAD是光敏物质，在操作时请注意避光。
  
• 本制品仅作科研用途！本制品仅作科研用途！

• 样品染色：
  
  • 悬浮细胞：300g，4℃离心5min收集细胞。
    贴壁细胞：用不含EDTA的胰酶消化后，300g，4℃离心5min收集细胞。胰酶消化时间不宜过长，以防引起假阳性。
    
  • 配制1×结合缓冲液：用去离子水4倍稀释4×结合缓冲液(4mL结合缓冲液+12mL去离子水)。
    
  • 用4℃预冷的PBS洗涤细胞2次，每次均需300g，4℃离心5min。
    
  • 加入1×结合缓冲液重悬细胞，调节其浓度为1～5×10⁶细胞/mL。
    
  • 取100μL细胞悬液于5mL流式管中，加入5μL Annexin V-BaFluor 488，轻轻混匀后于室温避光孵育5min。
    
  • 加入10μL 7-AAD(20μg/mL)。
    
  • 加入400μL PBS Buffer，混匀，样品在1小时内检测。
  • 为了避免洗涤细胞时损失细胞，在吸液时可以用大的Tip头套上小的Tip头吸液。
• 观察检测：
  
  • 流式细胞仪
    
    • 用流式细胞仪检测，Annexin V-BaFluor 488的激发波长Ex=495nm，发射波长Em=519nm，建议使用FL1通道检测；7-AAD的激发波长Ex=546nm；发射波长Em=647nm，发出红色荧光，建议使用FL3通道检测。用CellQuest等软件进行分析，绘制双色散点图，BaFluor 488为横坐标，7-AAD为纵坐标。每个样采集10000events。典型的实验中，细胞可以分成三个亚群，活细胞仅呈现很低强度的背景荧光，早期凋亡细胞仅呈现较强的绿色荧光，晚期凋亡细胞呈绿色和红色荧光双重染色。
      
    • 荧光补偿调节：使用未经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。
  • 荧光显微镜
    
    • 滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞；
      
    • 对于贴壁细胞来说，也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡；
      
      • 将细胞于盖玻片上生长，用适当的凋亡诱导剂诱导细胞凋亡，并设立阴性对照组；
        
      • 用PBS洗涤细胞两次；
        
      • 在500μL的结合缓冲液中加入1μL Annexin V-BaFluor 488，5μL 7-AAD染液混匀；
        
      • 将上述溶液滴加于盖玻片表面，使长有细胞的盖玻片表面均匀覆盖；
        
      • 室温避光孵育5min。
    • 将盖玻片倒置于载玻片上，在荧光显微镜下用双色滤光片观察。Annexin V-BaFluor 488荧光信号呈绿色；7-AAD荧光信号呈红色。