产品货号：
SY0468
中文名称：
蛋白A纯化预装柱,1mL
英文名称：
Protein A 4FF Chromatography Column,1mL
产品规格：
1ml|5×1ml
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本制品使用的是基因改造后的蛋白A，不仅维持其本身的Ig亲和特性，同时也去除了天然蛋白本身的非主要结合域以降低非特异性结合，rProtein A Agarose Resin 4FF以高度交联的琼脂糖凝胶为基质，重组Protein A为配基，具有很高的物理化学稳定性，可以在相对较高的流速下进行抗体的纯化，适用于工业客户。利用本制品经过一步亲和层析，即可从腹水、血清和培养液等样品中得到高纯度的抗体，使用方便，应用广泛。
本制品是一种装填了rProtein A Agarose Resin 4FF的中压预装柱，规格1mL，预装柱具有标准接口，可以适配商品化的各类中压色谱系统，如ÄKTA等，方便客户操作。
天然蛋白A(Protein A)是一种发现于金黄色葡萄球菌的细胞壁表面蛋白，与分离自G型或C型链球菌属的蛋白G类似，主要通过与免疫球蛋白(Ig)的Fc区相互作用，结合大多数哺乳动物的IgG，可用于多种抗体(单抗和多抗)的分离纯化。在与不用的免疫球蛋白亚类的结合特性上，ProteinA和Protein G结合性能不太一样(详见附录1)。
| 基质 | 高度交联的4%琼脂糖微球 |
| 配体 | 重组蛋白A |
| 孔径 | 45～165μm |
| 最大流速 | 0.3MPa,3bar |
| 储存缓冲液 | 含20%乙醇的1×PBS |
| 载量 | ＞40mg Rabbit IgG/mL基质 |
| pH范围 | 3-12 |
| 组分 | 1mL | 5×1mL |
| 蛋白A纯化柱 | 1mL | 5×1mL |
| 说明书 | 1份 | 1份 |
保存：2～8℃，有效期2年。
注：建议以下缓冲液在使用前用0.22μm或0.45μm滤膜过滤。
- 结合/洗杂缓冲液：0.15M NaCl,20mM Na2HPO4,pH7.0。
- 洗脱缓冲液：0.1M甘氨酸，pH3.0。
- 中和液：1M Tris-HCl，pH8.5。
- 请勿冷冻保存本制品。
- 所有操作过程中，样本需要在4℃或冰上操作。
- 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
- 本制品仅作科研用途！
注：上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH值，可以用结合/洗涤缓冲液对血清样品、腹水或细胞培养液稀释，或者样品用结合/洗涤缓冲液透析。
- 样品纯化(以Akta系统为例)
- 准备：将泵管道中注满去离子水。去掉上塞子，将层析柱连接至色谱系统中。再折断下口，将预装柱接到色谱系统中，并旋紧。
- 清洗：3～5倍柱体积去离子水冲洗层析柱中储存液。
- 平衡：用5倍柱体积的结合Buffer平衡层析柱，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用。
- 上样：将样品加到平衡好的层析柱中，推荐流速1mL/min，保证目的蛋白与树脂充分接触，提高目的蛋白的回收率，收集流出液，待检测。
注：样品的粘度增加使得即使上样体积很少，也会导致层析柱很大的反压。上样量不要超过柱子的结合能力。大量的样品体积也可能造成很大的反压，使得进样器更难使用。 - 洗杂：用10～15倍柱体积的洗杂Buffer进行清洗，直到紫外吸收达到一个稳定的基线，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。
- 洗脱：用洗脱Buffer采用一步法或线性梯度洗脱。一步洗脱中，通常5倍柱体积洗脱液足够将目的蛋白洗脱下来。也可以用一个小的梯度，例如20倍柱体积或更多，来分离不同结合强度的蛋白质。
- 清洗及保存：依次使用3倍柱体积的结合Buffer和5倍柱体积的去离子水平衡填料，最后再用5倍柱体积的20%的乙醇平衡，然后保存在等体积的20%的乙醇中，置于4度保存，防止填料被细菌污染。
- 准备：将泵管道中注满去离子水。去掉上塞子，将层析柱连接至色谱系统中。再折断下口，将预装柱接到色谱系统中，并旋紧。
- SDS-PAGE检测
将纯化过程中得到的样品(包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等)利用SDS-PAGE进行检测，判定其纯化效果。 - 树脂清洗
随着一些变性物质的沉淀和蛋白的聚集，往往造成流速和结合载量下降，影响柱子的性能，这时需对柱子进行清洗：- 去除沉淀或变性物质
- 用2倍柱体积的6M盐酸胍溶液进行清洗；
- 用5倍柱体积的PBS，pH7.4清洗。
- 用2倍柱体积的6M盐酸胍溶液进行清洗；
- 去除由于疏水性吸附造成的非特异吸附物质
- 用3～4倍柱体积的70%乙醇或2倍柱体积的1% Triton X-100清洗；
- 用5倍柱体积的PBS,pH7.4清洗。
- 用3～4倍柱体积的70%乙醇或2倍柱体积的1% Triton X-100清洗；
- 去除沉淀或变性物质
附录1.蛋白A，G对不同物种Ig的结合能力总表
| 免疫球蛋白亚型 | Protein A | Protein G | 免疫球蛋白亚型 | Protein A | Protein G |
| Human IgG | ++++ | ++++ | Mouse IgG | ++++ | ++++ |
| Human IgG1 | ++++ | ++++ | Mouse IgG1 | + | ++++ |
| Human IgG2 | ++++ | ++++ | Mouse IgG2a | ++++ | ++++ |
| Human IgG3 | + | ++++ | Mouse IgG2b | +++ | +++ |
| Human IgG4 | ++++ | ++++ | Mouse IgG3 | ++ | +++ |
| Human IgM | Use anti-Human IgM | Mouse IgM | Use anti-Mouse IgM | ||
| Human IgE | NR | NR | Chicken IgG (IgY) | NR | NR |
| Human IgA | + | NR | Cow IgG | ++ | ++++ |
| Human IgA1 | + | NR | Goat IgG | + | ++++ |
| Human IgA2 | + | NR | Goat IgG1 | + | ++++ |
| Human IgD | Use anti-Human IgD | Goat IgG2 | ++++ | ++++ | |
| Rat IgG | + | ++ | Goat IgM | NR | NR |
| Rat IgG1 | NR | + | Guinea Pig IgG | ++++ | ++ |
| Rat IgG2a | NR | ++++ | Guinea Pig IgG1 | ++++ | ++ |
| Rat IgG2b | NR | + | Guinea Pig IgG2 | ++++ | ++ |
| Rat IgG3 | + | ++ | Hamster IgG | + | ++ |
| Sheep IgG | + | ++ | Horse IgG | + | ++++ |
| Sheep IgG1 | + | ++ | Rabbit IgG | ++++ | +++ |
| Sheep IgG2 | + | ++ | Rabbit IgM | NR | NR |
| Sheep IgM | NR | NR | Rabbit All isotypes | +++ | ++ |
| Pig IgG | +++ | +++ | Monkey IgG | ++++ | ++++ |
| Cat IgG | ++++ | + | Donkey IgG | ++ | ++++ |
| Dog IgG | ++++ | + | |||
| (+)= weak binding;(++)= moderate binding;(++++)= strong binding;NR= not recommended;(-)= not tested; | |||||
附录2.常见问题与解答
| 问题 | 可能原因 | 推荐解决方法 |
| 柱子反压过高 | 填料被堵塞 | 清洗填料 |
| 裂解液中含有微笑的固体颗粒，建议上柱前使用0.22μm/0.45μm滤膜过滤。 | ||
| 样品纯化过程中曲线不稳 | 样品或buffer中有气泡 | 赶出气泡 |
| 样品和buffer进行脱气 | ||
| 洗脱组分中没有目的蛋白 | 样品中抗体浓度太低 | 使用其抗原做配体的介质 |
| 抗体被降解 | 适当的提高洗脱pH | |
| 样品与Protein A结合力低 | 换用Protein G或Protein A/G树脂纯化 | |
| 回收率逐渐减低 | 上样量太多 | 减少上样量 |
| 柱子太脏，载量降低 | 清洗树脂 |
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