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Caspase 3/7活性检测试剂盒图片
产品货号:
LA10317
中文名称:
Caspase 3/7活性检测试剂盒
英文名称:
Caspase 3/7 Activity Assay Kit
产品规格:
20T|100T
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
本产品是采用分光光度法检测细胞或组织裂解液中caspase 3/7酶活性或纯化的caspase 3/7酶活性的试剂盒。


Caspase (Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase 3也称CPP32、Yama或apopain,有时被写作caspase-3或caspase 3,属于caspase家族的CED-3亚家族(CED-3 subfamily),是细胞凋亡过程中的一个关键酶。Caspase 3是哺乳动物细胞中研究最多的一个caspase。Caspase 3和Caspase 7都可以剪切DEVD肽段序列,因此本试剂盒可以检测caspase3/7。


本试剂盒是基于Caspase 3/7可以催化底物Ac-DEVD-pNA产生黄色的pNA (p-nitroaniline),从而可以通过测定吸光度来检测caspase 3/7的活性。pNA在405nm附近有强吸收。


Caspase 3/7活性检测试剂盒
图1.HL60细胞分为未加药组(Con)和凋亡诱导组(Apo),分别使用我公司和其他进口品牌Caspase3/7活性检测试剂盒,加入底物孵育0h,2h,4h,6h,8h至过夜,分别记录酶标仪A405nm检测结果。图中红线代表Apo组,蓝线代表Con组,绿线表示blank组。从实验结果来看,我司组的检测灵敏度要好于进口品牌,凋亡诱导组的A405读数约为Con组3倍;而进口品牌仅为2倍,且读数低于我司组。


组分20T100T
裂解液(Lysis buffer)8mL30mL
检测缓冲液(Assay buffer)8mL20mL
Ac-DEVD-pNA(2mM)200μL1mL
pNA(10mM)200μL1mL
说明书1份1份

保存:-20℃,避光


本试剂盒用酶标仪检测或容量不超过100μL的分光光度检测杯检测时,除标准曲线外可以检测20个样品(20T)或者100个样品(100T)。


  • 准备工作:
    • 裂解液溶解后混匀并置于冰浴上备用。
    • 检测缓冲液溶解后混匀并置于冰浴上备用。
  • 测定pNA标准曲线:
    • 标准品稀释液的配制:按照每0.9mL检测缓冲液加入0.1mL裂解液的比例配制适量的标准品稀释液。
    • 把试剂盒提供的pNA (10mM)用标准品稀释液稀释为0、10、20、50、100和200μM,作为标准品。
    • 每个浓度取100μL用酶标仪进行检测,或取适当量用容量不超过100μL的分光光度检测杯进行检测,测定A405。
    • 每一个标准品的A405减去不含pNA的空白对照的A405计算出实际的因pNA而导致的吸光度,并制作出pNA浓度相对于A405的标准曲线。pNA标准曲线可以参考图1,在0~200μM范围内存在良好的线性关系。
      Caspase 3/7活性检测试剂盒
      图1.pNA标准曲线。实测数据可能因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异,图中数据仅供参考。
  • 样品的收集:
    • 对于悬浮细胞:把没有诱导凋亡的对照样品和诱导凋亡的样品,600g 4℃离心5分钟收集细胞,小心吸除上清,同时确保尽量没有细胞被吸除,PBS洗涤一次。同前吸尽上清后,按照每200万细胞加入100微升裂解液的比例加入裂解液,重悬沉淀,冰浴裂解15分钟。下转步骤3d。
    • 对于贴壁细胞:吸取细胞培养液,备用。用胰酶消化贴壁细胞,并收集至备用的细胞培养液中。600g 4℃离心5分钟收集细胞,小心吸除上清,同时确保尽量没有细胞被吸除,PBS洗涤一次。同前吸尽上清后,按照每200万细胞加入100微升裂解液的比例加入裂解液,重悬沉淀,冰浴裂解15分钟。
      下转步骤3d。
    • 对于组织样品:按照每3~10mg组织加入100微升裂解液的比例加入裂解液,在冰浴上用玻璃匀浆器匀浆。然后把匀浆液转移到1.5mL离心管中,冰浴再裂解5分钟。
    • 4℃ 16000~20000g离心10~15分钟。
    • 把上清转移到冰浴预冷的离心管中。
    • 立即测定caspase 3/7的酶活性或-80℃保存样品。同时可以取少量样品用Bradford法测定蛋白浓度,尽量使蛋白浓度达到1~3mg/ml,相当于每10微升待测样品中至少含有10~30μg蛋白。如果细胞较少,可以适当增加细胞的用量。
  • Caspase 3/7酶活性的检测:
    • 取出适量的Ac-DEVD-pNA (2mM),置于冰浴上备用。
    • 如下设置反应体系:
      成分空白对照样品
      检测缓冲液40μL40μL
      待测样品0μL50μL
      裂解液50μL0μL
      Ac-DEVD-pNA (2mM)10μL10μL
      总体积100μL100μL

      注意:在设置反应体系时先加检测缓冲液,再加待测样品,适当混匀,注意避免在混匀时产生气泡。随后再加入10μL Ac-DEVD-pNA (2mM)。
    • 加入Ac-DEVD-pNA (2mM)后混匀,注意避免在混匀时产生气泡。37℃孵育60~120分钟。发现颜色变化比较明显时即可测定A405。如果颜色变化不明显,可以适当延长孵育时间,甚至可以孵育过夜。
    • 样品的A405扣除空白对照的A405,即为样品中caspase 3/7催化产生的pNA产生的吸光度。通过同步骤1中获得的标准曲线对比就可以计算出样品中催化产生了多少量的pNA。
    • 参考Chemicon公司的caspase 3/7酶活力单位的定义:One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0nmol of the colorimetric substrate Ac-DEVD-pNA per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations。即一个酶活力单位定义为当底物饱和时,在37℃一个小时内可以剪切1nmol Ac-DEVD-pNA产生1nmol pNA的caspase 3/7的酶量。这样就可以计算出样品中含有多少个酶活力单位的caspase 3/7。说明:在本试剂盒的检测体系中,底物的起始浓度为0.2mM,此时底物是饱和的,对于许多样品而言在37℃孵育2个小时以内底物都是饱和的;对于样品中caspase3/7酶活力特别高的情况,须用裂解液适当稀释样品后再进行测定。
    • 用Bradford法检测待测样品中的蛋白浓度(由于裂解液中含有较高浓度的DTT,不适合采用BCA法进行蛋白浓度测定)。这样就可以计算出一个样品单位重量蛋白中所含的caspase 3/7的酶活力单位。



  • 测定出的A405过低:
    • 样品中蛋白含量太低,裂解样品时需设法使样品中的蛋白浓度至少达到1~3mg/ml。
    • 样品中激活的caspase水平很低。首先确认凋亡现象是否明显,如果凋亡比较明显并且确认该caspase是可以被激活的,可以适当调节诱导细胞凋亡的时间,希望能找到一个caspase激活比较强的时间点,这样就可以检测出该caspase的激活。可以作一时间曲线,例如诱导凋亡0、2、4、8、16和24小时,或0、1、2、4、8和16小时,或0、1、2、4、6和8小时等。具体的诱导凋亡时间需根据具体情况而定。
  • 测定出的A405过高或者样品量不足:
    测定出来的A405读数过高时,可以参考下表的反应体系适当减少样品的用量;样品量不足时也可以参考下表减少样品的用量。
    成分空白对照样品
    检测缓冲液40μL40μL
    待测样品0μLxμl
    裂解液50μL(50-x)μl
    Ac-DEVD-pNA (2mM)10μL10μL
    总体积100μL100μL

    说明:其中x≤50,其余检测方法同前文所述

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