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本试剂盒适用于培养细胞以及新鲜组织的caspase-9活性检测。

以偶联上发色基团pNA的caspase-9序列特异性的多肽为底物。当底物被caspase-9剪切后，发色基团被释放出来，进而用酶标仪或分光光度计来测定其吸光值（λ=405nm或400nm）。通过计算OD凋亡诱导组/OD阴性对照组的比值来确定凋亡诱导组caspase-9的活化程度。

Caspases是一个高度保守的半胱氨酸蛋白酶家族，特异性识别底物中的天冬氨酸残基，在介导细胞凋亡的过程中发挥着非常重要的作用。Caspases以潜在酶原的形式表达，通过自发蛋白分解机制或经其他蛋白酶（通常是其他caspases）加工处理的方式被活化。人caspases可细分为三大功能组：细胞因子活化（caspase-1，-4，-5和-13），凋亡启动（caspase-2，-8，-9和-10）和凋亡执行（caspase-3，-6和-7）。

Caspase 9）也称为Mch6，ICE LAP6和Apaf3，作为caspases家族的成员之一，含CARD结构域（caspase募集结构域），是细胞凋亡信号转导过程中比较上游的一个caspase。Caspase-9酶原分子量约47kDa，存在于胞浆内，一旦活化，转移到线粒体。Caspase-9参与caspase活化级联，负责凋亡执行，和切割/活化下游的caspase-3和caspase-6。当募集到Apaf1/细胞色素c复合物后，caspase-9被激活。Caspase-9的激活可通过磷酸化进行调控。

• 仪器：低温高速离心机、酶标仪或分光光度计（100μL的比色皿）（λ=405nm或400nm）、微量移液器、玻璃匀浆器（组织样本）
  
• 耗材：1.5mL微量离心管、96孔酶标板（透明）或100μL的比色皿
  
• 试剂：PBS、蛋白定量试剂（比如：Bradford法蛋白浓度测定试剂盒）

• Caspase-9 Substrate需避光保存和使用。
  
• 某些凋亡诱导剂诱导的凋亡可能通过caspase-9非依赖的方式进行，此种情况使用本品检测的caspase-9活性无明显变化，则，需要考虑凋亡机制中的其他信号通路。
  
• 起始细胞数量需达3～5×10⁶个或新鲜组织量达50～100mg，以保证达到测定所需的100～200μg蛋白量。Caspase-9的活性与细胞裂解后的蛋白含量有关，如测定的OD值偏低，可通过增加细胞数量或组织量的方法来提高蛋白量。
  
• 优先选择测定λ=405nm的吸光值；如有困难，再测定λ=400nm的吸光值。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• 试剂准备：
  
  • Lysis Buffer（含DTT）：于实验前，按每50μL Lysis Buffer加入0.5μL DTT的比例准备足量的裂解工作液，置于4℃或冰上待用。
    
  • 2×Reaction Buffer（含DTT）：于使用前，按每50μL 2×Reaction Buffer加入0.5μL DTT的比例准备足量的反应工作液。
• 样本准备：
  
  • 细胞裂解：
    
    • 用合适方法诱导细胞凋亡，同时设立阴性对照组（不加诱导剂），收集3～5×10⁶个细胞。
      
    • PBS洗涤细胞2次（2000rpm，离心5min），尽量吸尽PBS上清。
      
    • 往离心的沉淀细胞中加入15～200μL预冷的Lysis Buffer（含DTT），吹打混匀。
      
    • 置冰上裂解20～60min，其间涡旋振荡3～4次，每次10s；或冻融2～3次。
      
    • 4℃，10000rpm离心1min。
      
    • 小心吸取上清（含裂解释放的蛋白质）转移到新的EP管内，置于冰上待用。
      
    • 取少量上清（1～2μL），用常规方法（Bradford法）测定蛋白浓度。
  • 组织裂解：
    
    • 取50～100mg组织置于培养皿内，用手术剪剪碎成3mm×3mm左右的小块，加入150～200μL预冷的Lysis Buffer（含DTT），用玻璃匀浆器上下手动匀浆15次，注意低温操作。
      
    • 将组织匀浆液转移到1.5mL预冷的离心管，10000rpm，4℃离心5min。
      
    • 小心吸取上清（含裂解释放的蛋白质）转移到新的EP管内，置于冰上待用。
      
    • 取少量上清（1～2μL），用常规方法（Bradford法）测定蛋白浓度。
• Caspase-9活性检测：