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本制品为基于TdT生物素标记和HRP-DAB检测的TUNEL细胞凋亡检测试剂盒。TUNEL即TdT dUTP Nick-End Labeling，其原理是基因组DNA断裂时，暴露的3'-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）的催化下加上生物素标记的dUTP，经过SA-HRP信号放大和显色后，可以通过显微镜观察调亡细胞。

• 即开即用，用户不需要单独优化实验条件。
  
• 高灵敏度，可以在单细胞水平检测到细胞凋亡。
  
• 由于细胞一旦凋亡就有DNA断裂，故可以检测到早期的细胞凋亡。
  
• 基于TdT加尾法，更容易标记凋亡细胞而非坏死细胞。
  
• 起始材料是冷冻切片或石蜡切片。
  
• 本制品足够20张切片的TUNEL实验。

1. 如果一次实验要测试N张切片，最好准备N+2张，多出的两张一张标记为PC（TUNEL阳性对照），一张标记为NC（TUNEL阴性对照）。
   
2. 用自选常规方法对石蜡切片进行脱蜡和梯度水化。冷冻切片可跳过此步。
   
3. 浸入自备PBS中，室温放置5分钟。冷冻切片从此步开始。
   
4. 用自备4%多聚甲醛室温固定15分钟。
   
5. 浸入PBS中，室温放置5分钟。
   
6. 将切片取出放平台上，滴加50μL新鲜配制的DNase-free蛋白酶K工作液，室温孵育20分钟。此步处理将通透细胞并暴露细胞核中的DNA切口。蛋白酶K工作液配制方法是将10mg/mL的蛋白酶K溶液跟PBS按1:500的体积比混合即可。此溶液现配现用。
   
7. 浸入PBS 2次，每次室温孵育5分钟。此步可去除残留的蛋白酶K。

8. 在标注为PC的切片上滴加45μL PBS和5μL TUNEL专用DNase溶液，室温放置10分钟。由于每次实验（不是每个样本）才需要做一次阳性对照，故本试剂盒提供的TUNEL专用DNase溶液只够5次。
   
9. 用PBS洗涤PC切片3次，每次2分钟。
   
   处理PC切片需要专门的Coplin盒，因为如果混用，处理PC切片残留的DNase会提高背景，可能产生假阳性。

10. 在每张切片上滴加40μL PBS和10μL 5×TdT反应液，室温孵育15分钟（等待期间可以进行下步的操作）。孵育结束后覆盖液体的处理按第12步进行。
    
11. 在两个微量离心管中按下表新鲜配制两种TUNEL标记液。该溶液必须现配现用，没用完的不必保留。N+1块切片所需量按N+2配制：
    

    成分	标记液1（用于NC切片）	标记液2（用于其余切片）
    自备超纯水	44μL	43μL×(N+2)
    TUNEL底物液	1μL	1μL×(N+2)
    10×TdT反应液	5μL	5μL×(N+2)
    TdT酶	不加	1μL×(N+2)

12. 用滤纸放在切片边缘（不要碰触切片）小心吸走第10步加入到切片上的液体，吸走后马上加入标记液，盖上塑料盖片使液体均匀分布（不能使用玻璃盖片），然后再如法处理下一张切片。只是在NC切片上，需要滴加50μL标记液1，在其余切片上，需要滴加50μL标记液2。
    
13. 将所有放湿盒中37℃孵育60分钟。
    
14. 移除盖片，将切片放入自备2×SSC中浸泡10分钟。
    
15. 用PBS洗涤切片3次，每次5分钟。此步可充分去除未标记底物，避免其对后续反应的干扰。不能缩短。

16. 将切片浸入到新鲜配制的双氧水工作液中，室温孵育5分钟。双氧水工作液配制方法是将双氧水按1:100的体积比加入到PBS中混匀即可。
    
17. 用PBS洗涤三次，每次5分钟。
    
18. 在切片上滴加50μL新鲜配制的SA-HRP工作液，室温孵育20分钟。新鲜配制的SA-HRP工作液配制方法是将试剂盒提供的100×SA-HRP浓缩液按1:100的体积比跟PBS混合，轻柔混匀即可。本试剂盒提供的100×SA-HRP浓缩液足够配制1mL SA-HRP工作液，足够20张切片使用。
    
19. 用PBS洗涤3次，每次5分钟。
    
20. 新鲜配制DAB溶液。在装有DAB干粉的棕色管中，加入1mL DAB溶解液，盖上盖子后颠倒20次溶解。再按每张切片需要50μL DAB显色液的比例计算所需DAB显色液体积，并按下表配制（下表以配制1mL为例，用户如需要配制其他体积，可按比例增减各成分用量）：
    

    成份	用量
    DAB溶液	990μL
    DAB增强剂	10μL
    双氧水	1μL

21. 将50μL上步配制的DAB显色液滴加在每张切片上，室温避光放置10分钟。
    
22. 浸在超纯水中数次，空气中干燥后按常规操作封片并在显微镜下检测或照相。