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本试剂盒适用于培养细胞及新鲜组织caspase-9检测。


Caspase-9分光光度法检测试剂盒将caspase-9序列特异性的多肽偶联至发色基团，当该底物被caspase-9剪切后，发色基团即游离出来，可通过酶标仪或分光光度计(λ=405nm或400nm)测定其吸光值，可考察caspase-9的活化程度。


Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用。Caspase-9是级联酶的上游分子，可被线粒体向细胞质释放的细胞色素C激活。激活的Caspase-9可引起下游级联酶的活性，如Caspase-3。Caspase-9在正常状态下以酶原的形式存在于胞浆中，没有活性；但在细胞发生凋亡阶段时则被激活。

组分	20T	50T	100T	保存条件
Lysis Buffer	5.0mL	10.0mL	20.0mL	2～8℃
2×Reaction Buffer	1.0mL	2.5mL	5.0mL
Caspase-9 Substrate	100μL	250μL	500μL	-20℃，避光
100mM DTT	60μL	130μL	250μL

保存：-20℃，避光，有效期1年。


低温高速离心机、酶标仪或分光光度计(100μL的比色皿)(λ=405nm或400nm)、微量移液器、玻璃匀浆器(组织样本)；
1.5m L Microtube、PBS、蛋白定量试剂(可选购百奥莱博Bradford蛋白含量检测试剂盒，货号：KFS437)及仪器。

1. Caspase-9 Substrate避光保存及使用。
   
2. 对某些凋亡诱导剂引起的细胞凋亡可能存在非依赖于Caspase-9活化的机制，这种情况时利用本试剂盒检测Caspase-9活性无明显改变，需要考虑凋亡机制中的其他信号通路。
   
3. 细胞数量需达到3～5×10⁶个或新鲜组织50～100mg，以便能达到测定需要的100～200μg蛋白的要求，因为Caspase-9的活性与细胞裂解液的蛋白含量有关，如测定的OD值偏低，可通过增加细胞数量或组织量的方法来提高蛋白量。

1. 样品裂解
   
   1. 细胞裂解方法
      
      1. 用适当的方法诱导细胞凋亡，同时设立阴性对照组，并收集细胞；
         
      2. 用PBS洗涤细胞二次(离心2000rpm，5min)收集3～5×10⁶个细胞，尽量去除PBS上清；
         
      3. 在收集的沉淀细胞中加入100μL冰冷Lysis Buffer(注意：使用前每50μL Lysis Buffer加入0.5μL DTT)，吹打均匀；
         
      4. 置冰上裂解20～60min，其间涡旋振荡3～4次，每次10 s；或冻融2～3次；
         
      5. 4℃，离心(10000rpm) 1min；
         
      6. 小心吸取上清(含裂解的蛋白质)转移至新的管中，并放置冰上待用；
         
      7. 取少量上清(1～2μL)，常规方法(Bradford法)测定其中的蛋白浓度；
   2. 组织裂解方法
      
      1. 每50～100mg固体组织置于培养皿中，手术剪剪碎成3mm×3mm左右的小块，加入150～200μL冰冷Lysis Buffer(注意：使用前每50μL Lysis Buffer加入0.5μL DTT)，玻璃匀浆器上下手动匀浆15次，注意低温操作；
         
      2. 取组织匀浆液转移到1.5mL预冷的离心管，10000转/分，4℃离心5min；
         
      3. 小心吸取上清(含裂解的蛋白质)转移至新的管中，并放置冰上待用；
         
      4. 取少量上清(1～2μL)，常规方法(Bradford法)测定其中的蛋白浓度；
2. Caspase-9检测
   
   1. 吸取50μL含100～200μg蛋白的细胞或组织裂解上清；如体积不足50μL用10mM PBS,pH7.2～7.6补足至总体积50μL(各组均采用同样的蛋白量进行测定和比较)；
      
   2. 加入50μL的2×Reaction Buffer(注意：使用前每50μL 2×Reaction Buffer加入0.5μL DTT)；
      
   3. 加入5μL Caspase-9 Substrate并于37℃避光孵育4小时；
      
   4. 用酶标仪或分光光度计(100μL的比色皿)在λ=405nm或400nm测定其吸光值。通过计算OD_诱导剂/OD_阴性对照的倍数来确定凋亡诱导剂组Caspase-9活化程度。
      注意：以10mM PBS，pH7.2～7.6和Reaction Buffer作为空白对照。(50μL PBS + 50μL 2×Reaction Buffer)

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