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本试剂盒适用于培养细胞及新鲜组织Caspase-2检测。


Caspase-2荧光检测试剂盒将Caspase-2序列特异性的多肽偶联至发色基团。当底物被Caspase-2剪切后，发色基团即游离出来，可通过荧光酶标仪测定其荧光强度(激发波长=485nm，发射波长=535nm)。


Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中Caspase-2为关键的执行分子，与DNA断裂、染色质凝聚和凋亡小体形成有关。Caspase-2在正常状态下以酶原的形式存在于胞浆中，没有活性；但在细胞发生凋亡阶段，它被激活，活化的Caspase-2由两个大亚基和两个小亚基组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。

组分	20T	50T	100T	保存条件
Lysis Buffer	5mL	10mL	20mL	2～8℃
2×Reaction Buffer	2mL	5mL	10mL
Caspase-2 Substrate	6μL	15μL	30μL	-20℃，避光
100mM DTT	60μL	130μL	250μL

保存：-20℃，避光，有效期1年。


低温高速离心机、荧光酶标仪、微量移液器、玻璃匀浆器(组织样本)
1.5mL Microtube、PBS、蛋白定量试剂(可选购百奥莱博Bradford蛋白含量检测试剂盒，货号：KFS437或BCA蛋白含量检测试剂盒，货号：KFS438)及仪器。

1. Caspase-2 Substrate避光保存及使用。
   
2. 对某些凋亡诱导剂引起的细胞凋亡可能存在非依赖于Caspase-2活化的机制，这种情况时利用本试剂盒检测Caspase-2活性无明显改变，需要考虑凋亡机制中的其他信号通路。
   
3. 细胞数量需达到3～5×10⁶个或新鲜组织50～100mg，以便能达到测定需要的100～200μg蛋白的要求，因为Caspase-2的活性与细胞裂解液的蛋白含量有关，如测定的RFU值偏低，可以通过适当延长反应的时间，如果值还是不高，可通过增加细胞数量或组织量的方法来提高蛋白量。

1. 样品裂解
   
   1. 细胞裂解方法
      
      1. 用适当的方法诱导细胞凋亡，同时设立阴性对照组，并收集细胞；
         
      2. 用PBS洗涤细胞二次(离心2000rpm，5min)收集3～5×10⁶个细胞，尽量去除PBS上清；
         
      3. 在收集的沉淀细胞中加入100μL冰冷Lysis Buffer(注意：使用前每50μL Lysis Buffer加入0.5μL DTT)，吹打均匀；
         
      4. 置冰上裂解20～60min，其间涡旋振荡3～4次，每次10s；或冻融2～3次；
         
      5. 4℃，离心(10000rpm) 1min；
         
      6. 小心吸取上清(含裂解的蛋白质)转移至新的管中，并放置冰上待用；
         
      7. 取少量上清(1～2μL)，常规方法(Braford法)测定其中的蛋白浓度；
   2. 组织裂解方法
      
      1. 每50～100mg固体组织置于培养皿中，手术剪剪碎成3mm×3mm左右的小块，加入150～200μL冰冷Lysis Buffer(注意：使用前每50μL Lysis Buffer加入0.5μL DTT)，玻璃匀浆器上下手动匀浆15次，注意低温操作；
         
      2. 取组织匀浆液转移到1.5mL预冷的离心管，10000转/分，4℃离心5min；
         
      3. 小心吸取上清(含裂解的蛋白质)转移至新的管中，并放置冰上待用；
         
      4. 取少量上清(1～2μL)，常规方法(Braford法)测定其中的蛋白浓度；
2. Caspase-2检测
   
   1. 吸取30μL含100～200μg蛋白的细胞或组织裂解上清；如体积不足30μL用10mM PBS,pH7.2～7.6补足至总体积30μL(各组均采用同样的蛋白量进行测定和比较)；
      
   2. 加入50μL的2×Reaction Buffer(注意：使用前每50μL 2×Reaction Buffer加入0.5μL DTT)，然后加入10μL ddH2O；
      
   3. 加入10μL Caspase-2 Substrate反应液(19.5μL 2×Reaction Buffer +0.5μL Caspase-2 Substrate)并于37℃避光孵育1.5hr；
      
   4. 用荧光酶标仪测定荧光强度(激发波长=485nm，发射波长=535nm)。通过计算RFU_诱导剂/RFU_阴性对照的倍数来确定凋亡诱导剂组Caspase-2活化程度。
      注意：以10mM PBS,pH7.2～7.6和Reaction Buffer作为空白对照。(30μL PBS + 50μL 2×Reaction Buffer+20μL H2O)

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