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在正常的活细胞中，磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine，PS)位于细胞膜的内侧，但在早期凋亡的细胞中，PS从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。

Annexin-V能与PS高亲和力结合。可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。用标记了APC的Annexin V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。细胞坏死的过程中也会发生细胞膜损伤，坏死的细胞会结合Annexin V-APC。Annexin V-APC通常与细胞膜非渗透性核酸荧光染料联合使用以检测凋亡细胞。常用的染料是PI。正常细胞和早期凋亡细胞的细胞膜是完整的，核酸染料PI不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够透过细胞膜与细胞核结合呈现红色。

PI/Annexin V-APC试剂盒将Annexin V与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。坏死细胞可以同时与Annexin V-APC和PI结合显色，而PI则被排除在活细胞(APC阴性)和早期凋亡细胞(APC阳性)之外。在没有巨噬细胞的情况下，凋亡的最后阶段会像细胞坏死一样发生整个细胞的解体，从而使凋亡晚期的细胞也同时被APC和PI结合染色呈现双阳性。

在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为(APC-/PI-)；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为(APC+/PI+)；而右下象限为凋亡细胞，显现(APC+/PI-)。

• 方便：可用流式细胞仪；
  
• 快速：1小时内即可完成实验；
  
• 准确：能准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞，并计数各群细胞的比例。

• 螺旋盖微量管装试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上液体收集至管底，避免开盖时液体损失。
  
• 细胞处理需要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞。离心力在不损失细胞的前提下尽可能小，重悬细胞是动作要轻柔，避免多次反复的激烈吹打。不用涡旋振荡器。
  
• Annexin V-APC和PI是光敏物质，在操作时请注意避光，尽量减少它们暴露在光下的时间。有必要时可以使用带盖子的冰盒或铝箔纸避光。
  
• 由于细胞凋亡是一个快速和动态的过程，因此最好在染色后立即进行分析。
  
• 使用Annexin V-APC试剂盒检测凋亡需要针对活细胞。不要固定细胞，固定操作会对结果产生干扰。
  
• 如果细胞样品中含有血小板，如血液样品，请使用含有EDTA的缓冲剂并200g离心洗去血小板。因为血小板含有PS，能与Annexin V结合。
  
• 流式细胞仪检测时，细胞数量应不低于1×105。
  
• 如果细胞收集过程中使用了胰酶，需注意用PBS洗净去除残留的胰酶。残留的胰酶会消化并降解Annexin V-APC，最终导致染色失败。
  
• 贴壁细胞诱导凋亡时如有漂浮细胞，需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。中晚期凋亡细胞失去贴壁能力而漂浮于培养基，此部分细胞对结果有显著影响，不可随意丢弃，需离心后收集与贴壁细胞一起检测，才能全面的反映出细胞凋亡的整体情况；
  
• 对于贴壁细胞，消化是关键步骤。处理贴壁细胞要小心操作，尽量避免人为损伤细胞，胰酶消化时间过短，细胞需用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜损伤，PI摄入过多；消化时间过长，细胞膜同样易造成损伤，甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-APC的结合。消化时将胰酶铺满孔板底后，轻摇使胰酶与细胞充分接触，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段时间，待细胞间空隙增大，瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中应不用EDTA，EDTA影响Annexin V与PS的结合。
  
• 成功检测凋亡受以下几种因素影响，如细胞类型、细胞膜上PS的密度、发生凋亡时PS翻转的比例、诱导细胞凋亡的方法、所用试剂、诱导凋亡的时间以及实验过程中机械损伤的程度等，把这些影响因素进行优化对实验成功与否至关重要。务必根据每次实验样本类型和操作流程对这些步骤进行优化。
  
• 在进行流式细胞仪检测之前，事先进行显微镜观察有好处。
  
• 有极少数细胞株其细胞膜上PS的密度很低，难以染色，此时不适合用Annexin V方法检测凋亡。

• 离心收集悬浮细胞。300～500g离心，2～8℃，离心时间5分钟，弃培养基。
  注：
  ① 对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一离心管内备用。用不含EDTA的胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。
  ② 贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化后离心，收集细胞。胰酶消化时间不宜过长，以防损伤细胞膜，引起假阳性。
  ③ 检测贴壁细胞时，胰酶消化前，去掉的上清也要保留，因为可能存在一些掉下来的凋亡细胞，在胰酶消化后，再将这些上清加回去，一起离心后收集检测，结果更加准确。
  ④ 对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。
  ⑤ 离心转速根据平时该细胞实验时的转速即可。
  ⑥ 离心后小心吸除上清，可以残留约50μL左右的液体，以避免吸走细胞。加入约1mL 4℃预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。
  
• 用冷PBS洗涤细胞两次。(300g～400g，2～8℃，离心时间5分钟收集细胞)。
  
• 用100μL 1×Annexin V结合液悬浮细胞，浓度大约为1～5×106cells/ml。
  
• 在细胞悬浮液中加入5μL Annexin V-APC染色液，轻轻混匀后于2～8℃避光条件下孵育5～10分钟。
  
• 加入5～10μL PI染色液后轻轻混匀于2～8℃避光条件下孵育1～3分钟。
  
• 加入400μL PBS或1×Annexin V结合液，轻轻混匀。
  
• 立即用流式细胞仪检测。
  注：染色完成后要尽快上机检测，因为细胞在Annexin V结合缓冲液中存活时间不会太长。

• 未转染GFP等标记的细胞
  
  • 空白管：阴性对照组细胞，没有染色的细胞。不加Annexin V/APC，PI。用于调节电压。
    
  • 单染管：有明显凋亡的细胞，只加Annexin V/APC染色。用于调节补偿。
    
  • 单染管：有明显凋亡的细胞，只加PI染色。用于调节补偿。
    
  • 检测管：待测的处理细胞，加Annexin V/APC，PI。用空白管和单阳管调节好电压补偿后，获得所需要的流式数据。
• 转染GFP细胞
  
  • 未转染空白管：未转染细胞，阴性对照组细胞，没有染色的细胞。不加Annexin V/APC，PI。用于调节电压。
    
  • 转染GFP空白管：转染GFP对照组细胞，没有染色的细胞。不加Annexin V/APC，PI。用于调补偿。
    
  • 未转染单染管：未转染且有明显凋亡的细胞，只加Annexin V/APC染色。用于调节补偿。
    
  • 未转染单染管：未转染且有明显凋亡的细胞，只加PI染色。用于调节补偿。
    
  • 检测管：待测的处理细胞，加Annexin V/APC，PI。用空白管和单阳管调节好电压补偿后，获得所需要的流式数据。
    注：具体流式设置按常规方法即可。请参照流式细胞仪说明书或咨询仪器技术支持。

• 实验过程中Annexin V染不上色或阳性率偏低。
  
  • 确定实验中诱导剂是否能产生凋亡。可通过设定确切凋亡诱导效果的阳性药物对照来排除这情况。
    
  • 贴壁细胞消化不当。Annexin V跟PS的结合需要Ca2+离子，结合液中含有Ca2+，EDTA的消化会影响染色，建议使用无EDTA的胰酶，或者消化后用PBS洗涤干净。
    
  • 细胞离心用冷PBS洗涤后，应尽量吸干残余液体，残余过多的PBS中含有磷酸根，会形成磷酸钙沉淀，影响Annexin V的染色。
    
  • Annexin V结合液瓶盖要盖紧密封，长时间暴露于空气后，空气中的CO2进入后形成CaCO3会产生沉淀，从而减少游离的Ca2+，导致实验的结果不佳。
    
  • 污染其他的缓冲液。如吸取PBS后不换Tip头会导致游离的Ca2+的减少，从而导致实验的结果不佳。
    
  • 阳性细胞的丢失。如果是贴壁细胞，药物诱导后漂浮的细胞要收集起来合并检测，这部分细胞往往是凋亡阳性的细胞，丢弃会造成阳性结果偏低。
• 实验过程中阳性率偏高。
  
  • 细胞本身活力太差。实验中发现未经诱导凋亡的对照细胞经染色后AnnexinV+/PI+双阳性的细胞比例过高，造成这种结果的原因可能是细胞本身活力太差。建议用台盼蓝染色计算细胞的活力，台盼蓝拒染的细胞应大于95%。若活力偏低低，建议重新复苏细胞，通常刚复苏的细胞至少要传代3次以后才能进行实验。
    
  • 细胞操作不当。贴壁细胞消化过程中反复剧烈吹打导致细胞膜破坏，使得假阳性偏高。细胞洗涤、重悬等过程过于剧烈导致细胞膜损伤。Annexin V-APC会进入损伤的细胞膜，在细胞膜内部染色。
    
  • 凋亡诱导时间过长。一般情况下诱导几个小时就可以出现早期凋亡，因此通常不需要处理大于48小时以上，诱导时间过长会使营养物质耗尽，导致细胞状态差，假阳性结果偏高。