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本试剂盒是百奥莱博公司基于Calcein-AM/EthD-I双染料法细胞染色技术开发的，专门用于活细胞和死细胞双重荧光染色的试剂盒。

Calcein-AM是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，Calcein-AM由于在Calcein的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein留在细胞内，发出强绿色荧光。与其它同类试剂（如BCECF-AM和Carboxy fluorescein diacetate）相比，Calcein-AM是最适合作为荧光探针去染活细胞的，因为它的细胞毒性很低。Calcein的激发和发射波长分别为490nm和515nm。Calcein -AM仅对活细胞染色。

作为核染色染料的EthD-I不能穿过活细胞的细胞膜，它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光(激发：488nm，528nm，发射：617nm)，因此EthD-I仅对死细胞染色。

由于Calcein-DNA和EthD-I-DNA都可被490nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用545nm激发，仅可观察到死细胞。根据以上特点，Calcein-AM和EthD-I经常被结合用来作为活细胞和死细胞的双重染色。

• 长期不用可以-20℃保存。
  
• 染色液Calcein AM注意防潮；避免反复冻融。
  
• 染色液A为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。
  
• 注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。
  
• 试剂B溶解后需要用吸头吹打混匀。
  
• 试剂拆封后请尽快使用完！

• 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 细胞处理需要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞。
  
• 试剂A为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。
  
• 试剂A为了便于观察防止误操作导致损失，在试剂盒中时是采用透明管包装，收到后可以离心移入干燥黑色避光密封管或者用铝箔包裹避光。
  
• 由于Calcein-AM的稳定性比较差，染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。

• 染色工作液的配制：
  根据样品数按下列比例配制染色工作液。
  用染料稀释液试剂C将染色液A和B分别10倍稀释。
  每10mL HBSS缓冲液或无血清培养基中加入100μL稀释过的染色液A，充分混匀，即成染色工作液A。
  每10mL HBSS缓冲液或无血清培养基中加入20～200μL稀释过的染色液B，充分混匀，即成染色工作液B。
  
• 收集样本细胞。
  
• 用PBS洗涤细胞两次。
  
• 用200μL染色工作液A将细胞重悬。
  
• 在室温或37℃避光孵育15～20分钟。
  
• 用PBS洗涤细胞。
  
• 用200μL染色工作液B将细胞重悬。
  
• 在室温或37℃避光孵育2～5分钟。
  
• 用PBS洗涤细胞。
  
• 用适量PBS重悬细胞。
  
• 用荧光显微镜或流式细胞仪检测结果。最大激发为490nm，最大发射波长为515nm和617nm。

• 所有细胞都染上红色？
  EthD-I浓度过高会导致活细胞也被染色，需要优化EthD-I的使用浓度，稀释至仅对死细胞核染色，而不会对细胞质染色的最佳工作浓度。
  
• 细胞被同时染上绿色和红色？
  样本中有大量晚期凋亡细胞时，细胞胞浆会有Calcein着色并呈碎片状，而且EthD-I也为阳性。