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AO/EB双染细胞凋亡检测试剂盒是采用DNA探针双染细胞核的方法检测细胞的状态。吖啶橙(AO)具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。其激发波长为488nm，吸收波长为515nm。它与细胞中DNA和RNA 结合量存在差别，复合物可发出不同颜色的荧光,红色荧光为AO-DNA(F>600nm),绿色荧光为AO-RNA或单链DNA(F>530nm)。因此，在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光，或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。吖啶橙AO 常与溴化乙啶EB 合用双染，因EB 只染死细胞使之产生桔黄色荧光，由此可区分出正常细胞、凋亡细胞及坏死细胞。

储存条件：A液和B液-20℃避光保存。C液2-8℃保存。
有效期：一年。

注意事项：
●本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。
● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底，避免开盖时试剂损失。
● 禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。
● 样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。
● 最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并彻底清除残留清洁剂。
● 避免皮肤或粘膜与试剂接触。

试剂盒以外自备试剂和仪器：
● PBS ● 纯水 ● 移液器及吸头 ●离心机 ● 流式细胞仪或荧光显微镜

使用方法：

使用注意事项：
● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
●细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
●本染色试剂盒可用于细胞、细胞涂片等。以下以培养细胞的荧光显微镜检测为例，其他方法请参阅相关资料。
● AO 将DNA染成绿色，RNA染成红色，红色荧光在激发光下不久就会消失，等AO的红色荧光消失之后再拍照，否则会干扰EB的红色坏死细胞。

1．染色缓冲液的配制：根据样品数按下列比例配制染色缓冲液。取100μL试剂C加900μl无菌去离子水稀释，混匀即成染色缓冲液。
2．收集样本细胞，细胞数量在10×105个以内。
3．用PBS 洗涤细胞两次。
4．用500μl染色缓冲液将细胞重悬。
5．加入5μl AO染色液A。
6．加入5μl EB染色液B。
7．轻轻混匀后4℃避光孵育10-20分钟。
8．用PBS 洗涤细胞。
9．用荧光显微镜或流式细胞仪检测结果。AO-DNA 复合物的最大激发波长为488nm，最大发射波长为515nm，EB-DNA复合物的最大激发和最大发射波长分别为518nm和605nm。

结果分析：
正常活细胞的核染色质着绿色，形态结构正常；早期凋亡细胞的膜结构完整，核染色质着绿色，但核已开始固缩或呈串珠状；晚期凋亡细胞，核染色质发橙红色荧光，呈固缩状或串珠状，有时核碎裂散布于胞浆中；有时还可见到细胞核结构正常，但细胞着红色，为非凋亡的死亡细胞。
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