产品目录

本试剂盒提供了一种快速、简单、精确、均一的一种荧光分析法来对细胞活性进行检测，本试剂盒是基于强性氧化性、非荧光性、蓝色染料刃天青，接受了来自活细胞线粒体呼吸链中释放的电子时，被还原成粉红色荧光染料（试卤灵），产物试卤灵的总量与活细胞数量成直接比例关系。对细胞的增殖性和细胞毒性检测，用本试剂盒比用其他检测法（例如，MTT）具有更高的灵敏度，因为本试剂盒的组分非常适合于低细胞毒性分析，并且能进行长时间保温（例如24～48小时）。其具有高灵敏度（<100 CHO细胞），非放射性和无需洗脱等优点，这些特性使本试剂盒适用于细胞增值性和细胞毒性的高通量扫描筛选，本检测法可以便捷地用于配备有Ex/Em =~540/590nm滤光片装置的96和384微孔板分析中。

• 向具有黑色的侧壁和透亮底部的微型细胞培养板中每孔加入100到10000个细胞，每孔添加测试化合物，在37℃,5% CO₂细胞培养箱中孵育所需要的时间（如24小时、48小时或96小时）。未加细胞的空白对照，加入相同量的化合物，建议96孔板中每孔总体积100μL，384细胞微量板中加入50μL。
  
• 同时要建立下述的实验对照组。
  
  • 阳性对照组：含有细胞并已知细胞增殖或细胞毒曲线；
    
  • 阴性对照组：含有细胞，不加测试化合物.；
    
  • 空白对照组：含有细胞，加入溶解化学试剂的溶剂；
    
  • 无细胞对照组：仅含有细胞生产培养基，无细胞；
    
    • 血清中乳酸脱氢酶能产生背景荧光。
  • 化合物测试对照组：含有溶解测试化合物的溶剂比如汉克平衡缓冲液（HBSS）或磷酸盐缓冲液（PBS）和测试化合物。某些测试化合物有很强的自荧光性，可能会导致假阳性。
    
    • 所有的对照组中，要用培养基保证96孔板中总体积是100μL，384微型培养板中总体积50μL。
• 室温解冻Assay Solution，并使其回温至37℃，实验前彻底摇匀。
  
• 96孔细胞培养板中加入Assay Solution每孔20μL，384微型培养板中每孔10μL，轻轻摇培养板30秒。
  
• 在37℃，5% CO₂细胞培养箱中避光孵育1到24个小时。
  
  • 根据不同细胞类型的代谢率和细胞浓度，确定最佳的孵育时间；因为过长孵育时间可能会使指示剂转变为无色的化合物，所以不推荐延长孵育时间。
• 测定和计算在Ex/Em = 540/590nm处的荧光强度（底部读数），或者读取每孔的570nm的光度值（参考波长应该是600nm）确定的细胞活性。

• 背景荧光值是有细胞孔的荧光值和无细胞孔的值相减得到。
  
• 每孔的吸光值表明了每孔的细胞数目。
  
• 下面的公式是样品细胞活力比率和相应的曲线：
  % cell viability = 100×(F_sample–F₀)/(F_ctrl–F₀)
  F_sample是添加测试化合物的吸光度值；
  F_ctrl是未加测试化合物（只加了测试化合物溶剂的孔）组的吸光度值；
  F₀是无细胞组的吸光度的平均值。
  
  图1．CHO-K1细胞数目的响应值就是用荧光性细胞毒性检测试剂盒所测，使用柯仕达厂家的黑色侧壁透明底部的96孔细胞培养板，每孔总体积100μL，设置每孔0～10000个细胞梯度并加入测试试剂，过夜培养。每孔加入组分A20μL，37℃，孵育3小时。光吸收酶标仪分别读取540nm和590nm处的吸光值，如图所示，细胞的荧光曲线是线性的（相对系数=0.998），最低检测限时每孔60个细胞，插入小图是低浓度细胞数目响应值的放大图。