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细胞凋亡在许多生理过程中是至关重要的。目前已经描述了几种鉴定细胞凋亡的方法。核内解离被认为是凋亡的关键生化事件，导致双链，低分子量DNA片段以及高分子量DNA中的单链断裂。可以通过在酶反应中用修饰的核苷酸标记游离的3'-OH末端来鉴定那些DNA链断裂。末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）可以催化DIG-dUTP释放3'-OH DNA末端。DIG-dUTP首先与生物素偶联的抗地高辛抗体反应，后者与链霉抗生物素蛋白（SABC）结合。结合DAB，在显微镜下分析凋亡细胞染色黄色。

• 在染色过程中，避免组织干燥。
  
• 使用前，请将试剂盒所有组份离心。

• 样品制备:
  
  • 对于细胞涂片：在室温下用4%多聚甲醛固定30～60分钟，并用PBS冲洗两次，每次2～5分钟。
    
  • 对于冷冻切片：在室温下用4%多聚甲醛固定30～60分钟，并用PBS冲洗两次，每次2～5分钟。
    
  • 对于石蜡切片：根据标准方案进行脱水和脱水组织切片，并用PBS冲洗两次，每次2分钟。
• 加入50μL新鲜制备的3% H2O2，并在室温下孵育10分钟。
  
• 用双蒸水洗涤三次，每次2分钟。
  
• 用0.01M TBS将Protein K 200×(组分G)稀释成1×工作液。(0.01M TBS的制备：加入8.5g NaCl，1.2g Tris和0.45～0.5mL乙酸至1L双蒸水中，溶解，混匀。)
  
• 加入20～100μL Protein K工作液至样品中(仅限石蜡切片，细胞和冷冻切片不需要蛋白K消化），并在37℃下消化5～15分钟。然后用0.01M TBS冲洗3次，每次2分钟。
  
  • 最佳的消化时间应根据细胞类型，实验目的等因素决定。
• 反应混合物的制备：加入1μL TdT (组分B) and 1μL DIG-dUTP (组分C)至18μL Labeling Buffer (组分A)中，混匀。
  
• 将反应混合物加入到样品中，在二氧化碳培养箱中，37℃，孵育2小时。
  
• 用0.01M的TBS洗涤三次，每次2分钟。Rinse with 0.01M TBS three times,2minutes each time.
  
• 加入50μL Blocking Reagent (组分D)，室温孵育30分钟，丢弃阻断试剂，在此步骤无需洗涤样品。
  
• 用抗体稀释液(组分H)按照1:100的比例稀释生物素标记digoxin抗体(组分E)，混匀，加入50μL至样品中。
  
• 在二氧化碳培养箱中，37℃，孵育2小时
  
• 用0.01M TBS洗涤3次，每次两分钟。
  
• 用抗体稀释液(组分H)按照1:100的比例稀释SABC (组分F)，混匀，加入50μL至样品中。
  
• 在二氧化碳培养箱中，37℃，孵育2小时
  
• 用0.01M TBS洗涤3次，每次五分钟。
  
• 选购DAB显色试剂盒(货号：GS4974)，将900μL DAB Buffer、50μL DAB Substrate(20X)和50μL DAB Chromogen(20X)混合均匀，配制成DAB显色工作液。
  
• 在每个载玻片上加入50μL DAB显色工作液，避光，并在室温下孵育5～10分钟。
  
• 用双蒸水洗涤载玻片。
  
• 用苏木素染液染色5～10分钟.
  
  • 苏木素染色的时间依赖于所用苏木素的种类。
• 用双蒸水冲洗两次，每次5分钟。
  
• 75%乙醇中室温浸泡5分钟；
  
• 85%乙醇中室温浸泡5分钟；
  
• 95%乙醇中室温浸泡5分钟；
  
• 二甲苯室温浸泡15分钟，
  
• 中性树胶封片：加中性树胶盖玻片封片。