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本试剂盒是通过测量Caspase 9的活性而用于细胞凋亡检测的。Caspase 9是CED-3亚家族中的一员。活化的Caspase 9能切割下游caspases，例如caspase-3,-6和-7，起始Caspase级联反应。在正常发育的中枢神经系统中，活化的Caspase 9是凋亡所必需的。

本试剂盒利用Ac-LEHD-ProRed作为荧光指示器来检测caspas-9的活性。通过caspas-9的切割ProRed IETD产生强蓝色荧光，其发射光在~620nm，激发光为~535。本试剂盒提供所有必需组分。该实验稳定、快速且适应高通量筛选的需求。它不仅能够定量凋亡细胞中caspas-9的活性还能筛选caspas-8的抑制剂。很多实验室利用本试剂盒进行高通量抑制剂的筛选。

• 准备细胞
  
  • 贴壁细胞：对于96孔板，每孔接种90μL 20,000个细胞；对384孔板，每孔接种20μL 5,000个细胞；过夜培养备用；
    
  • 悬浮细胞：离心收集细胞，并重悬细胞，对于用多聚-D-赖氨酸包被过的96孔板，每孔接种90μL 20,000个细胞；对用多聚D-赖氨384孔板，每孔接种20μL 5,000个细胞；800rpm，2min，离心，备用；
• 准备caspase 9检测缓冲液：
  
  • 使用前该试剂盒需要在室温解冻。
    
  • 200X Ac-LEHD-ProRed储备液的制备：将65μL DMSO加入到Ac-LEHD-ProRed(组分A)中，混匀；
    
  • Caspase9检测缓冲液的制备：将50μL Ac-LEHD-ProRed储存液(200X，上一步制备)加入10mL of Assay Buffer(组分B)，混匀。
    
    • Caspase 9 Substrate (组分A)和Assay Buffer (组分B)保存在-20℃，需尽量避免反复冻融，请注意适当分装。
      
    • Caspasae 9检测缓冲液不稳定，需要现用现配。
• 检测方法：
  
  • 样品处理组：对于96孔板中，待检药物用PBS或配制所需缓冲液配制成10X待检药物溶液，每孔加入10μL待检测药物；对于384孔板中，待检药物用PBS或配制所需缓冲液配制成5X待检药物溶液，每孔加入5μL待检测药物；空白对照组（没有细胞的培养基）：加入相应体积的药物配制所需缓冲液；
    
  • 37℃，5% CO₂，培养箱中孵育，孵育时间受药物诱导细胞凋亡的快慢（十字孢碱，3～4小时诱导Jurkat细胞凋亡）；
    
  • 对于96孔板，每孔加入100μL caspase 9检测缓冲液；对于384孔板，每孔加入25μL caspase 9检测缓冲液（在2b步骤配制）；
    
    • 如果需要，加入1μL 1mM Ac-DEVD-CHO caspase 9抑制剂到到样品中，10分钟后再加入caspase 9检测缓冲液，以抑制caspase 9样酶激活。
  • 加入caspase 9检测缓冲液后，避光室温孵育至少1小时；
    
  • 800rpm，2min，离心细胞板，悬浮细胞一定要离心；
    
  • 检测Ex/Em = 535/620nm处的荧光强度。