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本试剂盒是通过测量Caspase 8的活性而用于细胞凋亡检测的。Caspase 8是一种Caspase蛋白，CASP8基因所编码。在神经元变性疾病中，例如亨廷顿综合症，caspase 8扮演着重要角色。Caspase 8已被证明具有底物选择性，其肽基序为Ile-Glu-Thr-Asp(IETD)。

本试剂盒利用Ac-LEHD-ProRed作为荧光指示器来检测caspas-8的活性。通过caspas-8的切割ProRed IETD产生强蓝色荧光，其发射光在~620nm，激发光为~535。本试剂盒提供所有必需组分。该实验稳定、快速且适应高通量筛选的需求。它不仅能够定量凋亡细胞中caspas-8的活性还能筛选caspas-8的抑制剂。很多实验室利用本试剂盒进行高通量抑制剂的筛选。

组分	规格
组分A:Ac-IETD-ProRed	1支
组分B:Assay Buffer	10mL

保存：-20℃，干燥避光。

• 准备细胞：
  
  • 贴壁细胞：对于96孔板，每孔接种90μL 20,000个细胞；对384孔板，每孔接种20μL 5,000个细胞；过夜培养备用；
    
  • 悬浮细胞：离心收集细胞，并重悬细胞，对于用多聚D-赖氨酸包被过的96孔板，每孔接种90μL 20,000个细胞；对用多聚D-赖氨384孔板，每孔接种20μL 5,000个细胞；800rpm，2min，离心，备用；
    
    • 最佳的诱导条件，根据细胞类型、细胞的大小、细胞增殖速度的快慢等因素而决定。
• 准备caspase 8检测缓冲液：
  
  • 使用前该试剂盒需要在室温解冻。
    
  • 200X Ac-IETD-ProRed储备液的制备：将65μL DMSO加入到组分A小瓶中混匀；
    
  • caspase 8检测缓冲液的制备：将50μL of Ac-IETD-ProRed Stock solution (200X，上一步制备)加入10mL of Assay Buffer (组分B)，混匀；
    
    • Caspase 8 Substrate (组分A)和Assay Buffer (组分B)保存在-20℃，需尽量避免反复冻融，请注意适当分装。
      
    • Caspasae 8检测缓冲液不稳定，需要现用现配。
• 检测方法：
  
  • 样品处理组：对于96孔板中，待检药物用PBS或配制所需缓冲液配制成10X待检药物溶液，每孔加入10μL待检测药物；对于384孔板中，待检药物用PBS或配制所需缓冲液配制成5X待检药物溶液，每孔加入5μL待检测药物；空白对照组（没有细胞的培养基）：加入相应体积的药物配制所需缓冲液。
    在37℃，5% CO₂，培养箱中孵育细胞板达所需时间诱导细胞凋亡（用喜树碱处理的Jurkat细胞4～6小时）。
    
  • 对于96孔板，每孔加入100μL caspase 8检测缓冲液；对于384孔板，每孔加入25μL caspase 8检测缓冲液（即2b步骤配制所得溶液）；
    
  • 加入caspase 8检测缓冲液后，避光室温孵育至少1小时；
    
  • 800rpm，2min，离心细胞板，悬浮细胞一定要离心；
    
    • 如果需要，加入1μL 1mM Ac-DEVD-CHO caspase 8抑制剂到到样品中，10分钟后再加入caspase 8检测缓冲液，以抑制caspase 8-样酶激活。
  • 检测Ex/Em = 535/620nm.处的荧光强度。
    
    • 有时，检测时细胞板底部及细胞板壁可能产生一些误差，因此细胞板一定要离心（特别是悬浮细胞），800rpm，2min。

处理组测量的荧光强度值减去空白对照组测量的荧光强度值；空白对照组测量的荧光强度值受到培养液中生长因子或者细胞版的材质等影响。

图1．检测Jurkat细胞中Caspase8活性。将Jurkat细胞同时接种于一个96孔板中（Costar），80,000 cells/90μL/孔。用十字孢碱（终浓度为1μM）处理Jurkat细胞，未处理组作为空白对照，处理时间为5小时。每孔加入100μL caspase 8检测缓冲液，室温孵育1小时。使用使用FlexStation酶标仪(Molecular Devices)测量荧光强度，Ex/Em =540/620nm。
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