细胞膜蛋白提取试剂盒

产品货号：

HR0029

中文名称：

细胞膜蛋白提取试剂盒

英文名称：

Cell membrane protein extraction kit

产品规格：

50T|100T

发货周期：

1～3天

产品价格：

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本试剂盒适用于从各种原代或传代细胞样本中提取膜蛋白，提取的膜蛋白纯度高，具有天然蛋白构象，不含核蛋白和胞浆蛋白。提取过程简单方便。

产品应用：

本试剂盒提取的蛋白可用于WB、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。
本试剂盒中不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。
本试剂盒提取的蛋白样本含有高浓度的盐成分，不可直接用于2D电泳，需要除盐后再用于2D电泳。如下游实验需要直接用于等电聚焦、双向电泳，请使用我司其他货号的试剂盒。

产品特点：

使用方便，提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。
提取过程简单方便。
含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
蛋白提取液含多种有效成分，可以充分释放胞浆蛋白和膜蛋白，又可结合释出的蛋白防止沉淀。
蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、Bestatin、E-64，每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

产品组成：

组分	50T	100T
试剂A：蛋白提取液A	20mL	40mL
试剂B：蛋白提取液B	250μL	500μL
试剂C：膜蛋白溶解液C	10mL	20mL
试剂D：蛋白酶抑制剂混合物	100μL	200μL

保存：蛋白提取液、膜蛋白溶解液2～8℃保存；蛋白酶抑制剂-20℃保存。有效期1年。

保存事项：

蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2～8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
蛋白酶抑制剂在2～8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。

自备器材：
离心机、振荡器、涡旋混匀器、移液器、PBS、蛋白定量试剂盒

注意事项：

旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
Western Blot实验内参可以选用Na-K ATPase。
提取液A在使用前需一直置于2～8℃保存，否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。
膜蛋白电泳时Loading buffer应该避免煮沸。
膜蛋白电泳时可以提高Loading buffer的SDS含量。

使用方法：

提取液制备：
每200μL提取液A中分别加入2μL提取液B和2μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
注：
● 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。
● 提取液A在使用前需一直置于2～8℃条件，否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。
● 以下步骤使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。
取5～10×10⁶个细胞，在4℃,500×g条件下离心2～3分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
注：
● 细胞数量根据实验情况调整。由于膜蛋白含量较少，需要较多的细胞才能保证得率。
● 在条件允许的情况下，尽可能加大细胞上样量。
用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
在细胞沉淀中加入200～400μL冷的提取液A，高速涡旋振荡5秒，置2～8℃条件振荡30分钟～1小时。
注：
● 必须2～8℃低温振荡。
● 用振荡器/摇床的较低转速，保持液体能晃动即可。
● 没有低温振荡条件可以不振荡，置2～8℃静置，延长时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。
● 提取液A处理后细胞沉淀应明显减少，否则延长处理时间。
然后在4℃,12000×g条件下离心5分钟，收集上清，弃沉淀。
将上清吸入另一干净离心管，置37℃水浴10分钟。然后在37℃,500×g力离心2分钟。
注：
● 必须37℃水浴和离心。
● 没有37℃离心条件可以不离心，延长水浴时间至液体澄清分层明显即可。
此时溶液分为两层，小心移除上层，留下管底部下层大约20～50μL液体。
注：
● 下层为粘稠状液体。
用30～100μL膜蛋白溶解液C溶解该液体，即得膜蛋白样品。
注：
● 膜蛋白比较难溶解，不能很快溶解混匀，可以在加入溶解液后稍微吹打混匀，然后置于4℃冰箱静置至溶解。中途用移液器轻轻吹打混匀一次。静置后取出再次用移液器稍微吹打混匀即可。
● 于4℃静置直至管底透明胶状物完全溶解。
将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
注：
● 建议用BCA法进行蛋白定量。
● 蛋白样品-80℃存放一年没问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

常见问题：

蛋白浓度低？
膜蛋白丰度较低，需要尽可能加大细胞上样量。处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂A的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
用什么方法定量蛋白？
建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
提取的蛋白具有活性吗？
本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。
膜蛋白电泳没有条带？
膜蛋白样品通常浓度较低，电泳前一定要进行蛋白定量，以保证电泳是蛋白上样量足够。蛋白样品中含有去垢剂，注意蛋白定量方法的选择，防止不合适的方法导致的蛋白浓度数据异常偏高，从而导致依据错误的蛋白浓度数据上样导致上样量不够。
膜蛋白提取好后，用溶解液充分溶解后，可以超声处理一下，再进行蛋白定量。
蛋白加Loading Buffer后可以不用煮沸，采用50℃保温30分钟。
蛋白Loading Buffer中SDS终浓度含量可以提高至3%～10%。
有些样品的膜蛋白含量太低，可以使用丙酮沉淀膜蛋白，再使膜蛋白溶解于上样缓冲液中，一般可以跑出清晰的蛋白条带。电泳时最好采用低电压低电流电泳。

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