柱式植物叶绿体DNA提取试剂盒

产品货号：

BTN120406

中文名称：

柱式植物叶绿体DNA提取试剂盒

英文名称：

Plant Chloroplast DNA column extraction kit

产品规格：

15次

发货周期：

1～3天

产品价格：

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本试剂盒是结合植物叶绿体纯化试剂盒和柱式植物DNA抽提试剂盒而推出的新兴产品，专门用于植物叶绿体DNA的快速提取。

产品特点：

纯度高，不含污染和抑制剂，可以直接用于酶切、PCR、real-time PCR、multiplex PCR、RAPD、RFLP、AFLP、Southern Blotting,microsatellite analysis等各种后续分子生物学实验，不会发生离心柱堵塞现象。
产率一般在1～2μg/1g叶片样品。OD260/280一般在1.8以上。DNA片段长度一般在40～50 Kb左右。
本产品足够15次提取，每次可处理30g叶片。
已经成功用于菠菜，大豆，莴笋，白菜，烟草和甜菜等双子叶植物，也适用于单子叶等其他植物（可能需要优化条件）。

产品组成：

组分	规格
叶绿体纯化匀浆液成分一	2×250mL
叶绿体纯化匀浆液成分二	3g
Percoll	60mL
带柄尼龙滤膜	1个
叶绿体DNA纯化溶液A	15mL
叶绿体DNA纯化溶液B	7.5mL
叶绿体DNA纯化溶液C	30mL
离心吸附柱	15套
通用洗柱液	15mL
DNA洗脱液2.0	10mL

保存：常温，有效期一年。其中匀浆液成分二长期保存时需要放4℃。

自备器材：
去离子水、氯仿、Waring匀浆机、烧杯、量筒。

使用方法：
注意：叶绿体对温度高度敏感，所以整个操作必须在冰上或者在冷室进行，所用器皿和溶液均需要在4℃预冷。离心时一定要在4℃进行，离心力以g而不是rpm计算。如果需要研究叶绿体的功能，提取还需要在昏暗的光线条件下进行。强烈建议用显微镜监控整个过程中叶绿体的回收情况。
一、叶绿体的纯化

实验前1～2天将植物放在暗室培养以减少叶绿体中淀粉颗粒的形成，否则离心时这些颗粒很容易使叶绿体破裂。叶片在实验前需先用自来水洗净，再用蒸馏水淋洗，去掉多余水分。如果叶片采集后不能立即处理，则保存时需要保持叶片湿润，即使如此，叶片的放置时间也不能超过一天。
计算实验所需叶绿体匀浆液的体积（下面简称匀浆液），本试剂盒一次实验可处理30g叶片，对一般植物，每克叶片需要准备4mL匀浆液，则一次实验需要准备120mL匀浆液。对烟草和大豆，每克叶片需要6mL匀浆液，则一次实验需要准备180mL匀浆液。为了保险可以多配10%。
实验当天制备匀浆液。制备方法是：将自备的去离子水与试剂盒提供的匀浆液成分一在干净的玻璃或塑料容器中按4：1的比例混合，然后在每100mL混合液中加入匀浆液成分二干粉0.1g（终浓度为0.1%），轻柔搅拌10分钟后，所得溶液即为匀浆液。冰上预冷待用。匀浆液只能当天使用，不能放置。
预留1.5mL用于悬浮叶绿体，其余匀浆液转移到Waring匀浆机（即家用制备果汁的匀浆机）中，再快速将新鲜植物叶片的叶脉去除，再将叶片剪成1-3cm2大小的碎片，浸泡在匀浆机里面的匀浆液中。
低速匀浆10秒，避免起泡沫。用玻璃棒把液面的叶碎片按入到匀浆机底部，再低速匀浆10秒。注意：还可用Dounce玻璃匀浆器，Polytron匀浆机和研磨（加玻璃珠）等匀浆，但它们单次处理量小，需分成很多份处理后再汇集，非常不方便。
用带柄尼龙滤膜过滤匀浆液，用预冷的200mL量筒收集穿透液，再等分到4个预冷的50mL的塑料离心管中（每个管中的穿透液不要超过35mL）。带柄尼龙滤膜洗涤干净后可反复使用。
在水平转子离心机上4℃ 200g离心3分钟（对菠菜，白菜和莴笋材料）或400g离心1分钟（对甜菜材料），白色沉淀为未破裂的细胞或细胞核。其他植物材料则需要用户自己摸索最佳离心力。
将上清液（含叶绿体）转移到一个新的、预冷的50mL塑料离心管中。
在水平转子离心机上4℃ 1000g离心7分钟，小心弃上清，沉淀含叶绿体。
在沉淀中加入1.5mL预冷的匀浆液，手弹离心管底部使叶绿体重悬。
注意：重悬时最好避免溶液起泡，也不要用枪头吹打，否则叶绿体容易破裂。沉淀下有白色淀粉属于正常现象，但重悬叶绿体时避免将白色淀粉重悬。
将4管叶绿体重悬液汇集（共约6mL），得到叶绿体粗提液。
如果对叶绿体DNA是否含细胞核DNA的要求不高，则叶绿体粗提液可以直接用于叶绿体DNA纯化，具体操作是在水平转子离心机上4℃ 1000g离心7分钟，小心弃上清，沉淀为叶绿体，直接用于DNA纯化（见步骤二）。
如果需要无细胞核DNA污染的叶绿体DNA，则按以下流程操作：在50mL塑料离心管中先加入6mL匀浆液成分一和4mL的Percoll，充分混合均匀得到40%的Percoll溶液，在其液面上小心铺上6mL的叶绿体粗提液，在水平转子离心机上4℃ 1700g离心6分钟，管底绿色沉淀为完整的叶绿体，液面的绿色部分为破碎的叶绿体。小心将上清去除后，直接将沉淀（完整叶绿体）用于叶绿体DNA纯化（见步骤二）。

二、叶绿体DNA的纯化
溶液A和溶液B容易产生沉淀，溶液B十分粘稠，均需65℃溶解并摇匀后待用。

将600μL预热的溶液A加入到叶绿体沉淀中后充分吹打混匀。
加入300μL预热的溶液B，震荡混匀10～30秒。注意：溶液B非常粘稠，可以采取称量方法称取300mg（约等于300μL）使用或将1mL枪头剪去一截后再吸取300μL使用。
65℃放置3～5分钟。如果室温放置，DNA产量会降低10～20%。
加入200μL自备氯仿，震荡混匀10～30秒。
12000rpm室温离心2分钟。此时上清液将变得透明，中间层有白膜。小心转移上清液（约0.8mL）到一个新的3～5mL离心管中，避免触及中间层的白膜，可留少量上清不取。
加入1.5倍体积(约1.2mL)的溶液C，颠倒混匀后先转移0.7mL到离心吸附柱中，室温放置至少2分钟。12000rpm室温离心1分钟，DNA将吸附在离心吸附柱的膜上，倒弃收集管中的穿透液。
再将剩余的溶液按上步方法上柱。
将0.5mL通用洗柱液加入到吸附柱中，12000rpm室温离心1分钟，弃穿透液。重复操作一次。空甩半分钟去除残留液体。
将离心吸附柱放置在一新的1.5mL塑料离心管中，加50～100μL DNA洗脱液2.0，室温放置3～5分钟。
12000rpm室温离心1分钟即得植物叶绿体DNA溶液，直接取5～10μL电泳检测，其余放冰箱备用。

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