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技术文章 > 非变性蛋白电泳Marker转膜问题

  • 所有的预染蛋白Marker都是变性Marker,不适用于非变性电泳。
  • 蛋白非变性电泳条件下,不能精确判断蛋白的分子量大小。因为在非变性条件下,蛋白的电荷,空间结构,物化性质等都对蛋白的迁移有影响。
  • 非变性蛋白电泳Marker(RFT264RFT212)由于要保持蛋白的天然结构,都没有偶联染料,在电泳时基本都看不到条带;然而,RFT264中的440kD和880kD由于天然蛋白中含有铁离子,使得电泳后在胶上可见淡黄色,其中440kD颜色更深。凝胶转膜后,膜上也可以看到黄色的440kD条带(下图),可以大体判断Marker转膜的效果。
    2×TBE尿素上样缓冲液(用于尿素变性胶)
  • 有两种方法可以解决非变性Marker转膜后条带显示问题:
    第一种方法:凝胶转膜后用丽春红染色液(货号:RFT056)染膜,可以看到Marker条带,顺便可以检测转膜效率,然而要注意的是丽春红染色灵敏度比较低,可能不能完全看到完整的Marker条带。
    2×TBE尿素上样缓冲液(用于尿素变性胶)
    第二种方法(下图):电泳结束后,把含有Marker泳道的凝胶切下,单独用考马斯亮蓝染色液染色(货号:RFT053),剩余的凝胶去完成转膜到ECL发光检测过程,最后的发光结果和Marker染色结果拼接判断条带范围。
    2×TBE尿素上样缓冲液(用于尿素变性胶)
    Jurkat细胞BN电泳GAPDH检测
    凝胶:8% BN凝胶
    电泳:1×蓝色电泳缓冲液(含0.01% G-250)稳压150V 43分钟;1×无色电泳缓冲液稳压150V 35分钟
    转膜:1×BN转膜缓冲液(不含甲醇),稳流200 mA (电压72-60V) 1.5小时,未冰浴
    膜漂洗去蓝色:PVDF膜无水甲醇浸泡10分钟至膜无色封闭:无蛋白快速封闭,RT,30分钟
    一抗:GAPDH兔多抗(货号:RFT333),1:5000过夜孵育
    二抗:HRP标记羊抗兔IgG(货号:RFT340) 1:5000 RT 1小时
    ECL检测:ECL发光(货号:RFT083),曝光3.5min
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