技术文章 > 彗星电泳法检测DNA损伤方法

实验原理：
当各种内源性和外源性因素诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到电解液中，而核DNA由于分子量太大不能进入凝胶而留在原位。

检测方法：

• 中性处理：在中性条件下，DNA维持双链构象，因而仅可以检测双链断裂。
  
• 碱性处理：在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。由于这些DNA的相对分子质量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA向正极迁移形成彗星状图像。

实验操作：

• 将细胞固定于低熔点琼脂糖中；
  
• 用裂解液破坏细胞膜；
  
• 再用碱溶液使DNA分子解旋；
  
• 将载玻片置于电泳液中，在电场的作用下，DNA分子向阳极移动。

结果分析：

• 如果DNA损伤严重，则产生的碎片就越多、越小，向阳极迁移的DNA碎片量就越多，迁移距离也越长，荧光染色后就能看见“彗星”样尾长并且荧光强度增强。
  
• 未受损伤的DNA大分子则由于细胞膜的阻隔，滞留在原处。
  
  图1．引自文献

数据处理：

• 在拍照时以tif格式保存图片，然后点击下图的绿色框选的位置导入文件。
  
• 打开view下拉菜单，选“resultwindow”，在分析后您就可以看到您的结果窗口。分析之前最好把右侧的head和tail选中，(红色框选部分，这样可以出现头、尾分明的视觉效果)
  
  
• 用白色画框选中要分析的区域
  
  
• 图中数字表示：
  1是翻页，2是分析，3是保存，4是调整背景调整，5是进入正式分析
  调整好位置后，开始分析前要点击“5”，然后点“ 2”，再点“ 3 ”，这样一张图的数据就分析完了，数据会保存在系统里。点击“翻页”可以继续分析下一张图。
  绿色框选所指区域是分析后的曲线，主曲线图下面列举了几个数据，全部结果在结果窗口。
  
• 将分析窗口最小化(点击下图红色框选部分)可以预览分析好的数据
  
  
• 分析完所有图片后导出数据保存成txt格式，保留TailDNA%(尾部DNA百分含量)，TailLength(尾长)，TailMoment(尾矩)三列数据，下图为细胞展示图。
  
  
• 根据彗星尾部荧光强度占总强度的百分比(TailDNA%)将采集的细胞图像分为5个等级。
  

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