专题方案 > microRNA(miRNA)定量检测方案(TaqMan探针法)

本方案作为microRNA定量研究的金标准，具有高特异性、高灵敏度的特点。主要把包括三个部分：microRNA提取，TaqMan microRNA反转录和荧光定量(TaqMan探针法)


一、一步法microRNA提取技术，仅通过上柱、结合、洗脱即可获得高纯度的小RNA（<200nt），无需额外去除大RNA，由该方法获得的小RNA尤其适合于miRNA的定量PCR试验，适用于动物、植物、细胞、全血等样本的小RNA提取。

二、TaqMan microRNA反转录试剂盒：操作简单，仅需两步即可完成miRNA cDNA的合成。同时，采用加A法进行miRNA的反转录，其转录效率远高于茎环法，因此可极大的提高检测灵敏度。

三、microRNA荧光定量PCR试剂盒(TaqMan探针法)：采用FAM标记TaqMan探针和特异性上游引物进行miRNA定量检测，有效的确保了扩增的高特异性和高灵敏度。


本解决方案示意图：



配套产品：

步骤	名称	货号	规格
第一步：提取	组织/细胞microRNA提取试剂盒	MT0001	25T|100T
	全血microRNA提取试剂盒	MT0002	25T|100T
	血清血浆microRNA提取试剂盒	MT0003	25T|100T
第二步：反转录	TaqMan microRNA反转录试剂盒	MT0006	25T|100T
	血清/血浆TaqMan microRNA反转录试剂盒	MT0007	25T|100T
第三步：定量	microRNA荧光定量PCR试剂盒(TaqMan探针法)	MTTXXXXX	20μl×100次
内参基因定量	RNU6B定量PCR试剂盒 (适用于人、鼠等哺乳动物组织、细胞样品)	MTT01501	20μl×100次
	TaqMan miR-16定量PCR试剂盒 (适用于来源于人、鼠全血样品)	MTT01511	20μl×100次

方案实例：


1．极佳的线性关系，高灵敏度

图1：连续6个浓度梯度(100pM、10pM、1pM、100fM、10fM、1fM)miR-21、miR-7和miR-16标准品，使用microRNA荧光定量PCR试剂盒(TaqMan探针法)进行检测，结果表明具有极好的线性关系(R＞0.98)


2．100个细胞（低样本量）的miRNA检测

图2：消化离心正常培养的A594肺癌细胞，通过细胞计数取100个细胞．采用快速组织细胞microRNA提取试剂盒(MT0001)提取该100个细胞的microRNA (洗脱体积25μL) 。取4μL提取的microRNA, 采用TaqMan microRNA反转录试剂盒(MT0006)反转录获得microRNA的cDNA. 取2μL的cDNA产物使用microRNA荧光定量PCR试剂盒(TaqMan探针法)来检测hsa-miR-1(货号：MTT01113)、 hsa-let-7e(货号：MTT01341)、hsa-miR-302b(货号：MTT01466)、内参使用RNU68(货号：MTT01501)。结果表明，使用本解方案可清晰检测到100个细胞的microRNA分子(高信噪比)。采用传统茎环法(SYBR Green)均无法检测到。


3．全血样本的miRNA检测

图3：用全血microRNA提取试剂盒(MT0002)提取150μL抗凝全血的microRNA(洗脱体积20μL)。取4μL提取的microRNA, 采用TaqMan microRNA反转录试剂盒(MT0006)反转录获得microRNA的cDNA。取2μL的cDNA产物使用microRNA荧光定量PCR试剂盒(TaqMan探针法)来检测hsa-miR-7(货号：MTT01346)、hsa-miR-21(货号：MTT01108)、hsa-miR-9(货号：MTT01109)、内参使用hsa-miR-16(货号：MTT01109)。结果表明，使用本解方案可清晰检测到样本中的microRNA分子(高信噪比)。